苯酚-硫酸法快速測定多糖方法的優化

羅春萍， 陸友利，王星星(臺州科技職業學院，浙江 臺州 318020)

0 引言

苯酚-硫酸法是常用的測定多糖含量的方法之一[1]，該方法利用多糖在濃硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，然后再與苯酚縮合生成具有紫外吸收特性的有色化合物進行比色測定，具有操作簡單、顯色組分相對穩定、重復性好等優點[2-3]。苯酚-硫酸法多采用紫外分光光度計進行檢測，由于受到比色槽數量的限制，測定多個樣品時，操作較繁瑣，比較費時，且實驗過程中消耗較多濃硫酸并產生大量廢液，對操作人員和環境易造成危害[4]。酶標儀與紫外分光光度計的測試原理相同[5]，但具有96個比色槽，可批量完成多個樣品的測定，大大提高檢測效率。因此，本研究以酶標儀代替紫外分光光度計為測定儀器，以葡萄糖為標準品，通過實驗優化苯酚-硫酸法測定多糖的反應條件，探索多糖批量快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；WD-2102A全自動酶標儀 北京六一生物科技有限公司；96孔單條可拆酶標板 海門捷泰實驗器材有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗溶液的配制

(1)葡萄糖標準溶液的配制。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準物質200mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL，配成2.0mg/mL的葡萄糖標準品母液；然后分別移取0、1、2、3、4、5mL葡萄糖標準品母液，置于100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，搖勻，即得濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標準溶液，避光保存備用。

(2)5%苯酚溶液的配制。取一個干燥小燒杯稱取5g固體苯酚，加蒸餾水溶解并定容至100mL，轉至棕色瓶中4℃保存備用。

1.2.2 檢測波長的確定

移取100μg/mL的葡萄糖標準溶液1mL加入試管中，以1mL蒸餾水作空白，室溫下加入5%苯酚溶液1mL、濃硫酸5mL，迅速搖勻后，置40℃水浴反應10min，冷水終止反應，紫外分光光度計掃描400～600nm波長范圍的吸光度，以最大紫外吸收波長作為酶標儀檢測的波長。

1.2.3 單因素試驗設計

以100μg/mL葡萄糖標準溶液200μL為研究對象，酶標儀檢測波長為490nm時的OD值作為評價指標，分別考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、濃硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反應溫度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反應時間(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素對OD490nm值的影響[6]。

1.2.4 正交優化試驗

在1.2.3單因素試驗結果的基礎上，選擇苯酚用量(A)、濃硫酸用量(B)和反應溫度(C)3個因素為自變量，以OD490nm值為評價指標，進行L9(33)正交試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 標準曲線制作

以蒸餾水為空白，分別精密吸取濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標準品溶液各200μL加入2mL具塞塑料離心管中，在每支離心管中加入5%苯酚溶液200μL、濃硫酸700μL后，迅速搖勻，80℃水浴10min后，冷水浴5min終止反應，精密吸取各反應液加入96孔酶標板，每個樣品加3個孔，每孔200μL，采用酶標儀在490nm波長下測定OD值，以葡萄糖濃度為橫坐標，OD490nm值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 酶標儀測定多糖的可行性分析

精密吸取濃度為40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標準品溶液各200μL加入2mL具塞塑料離心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、濃硫酸反應后，酶標儀測定OD490nm值，并根據標準曲線計算多糖含量。

2 結果與分析

2.1 酶標儀檢測波長的確定

采用苯酚-硫酸法對葡萄糖標準品進行測定，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長范圍內進行掃描，結果如圖1所示，葡萄糖標準品在490nm處有最大吸收峰，故可選擇490nm作為酶標儀檢測波長。

圖1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖的紫外吸收光譜圖

2.2 單因素實驗結果

由圖2(A～C)可知，苯酚用量為200μL、硫酸用量為700μL、反應溫度為80℃時，OD490nm值最大；圖2D可知，不同反應時間下，OD490nm值保持一個相對穩定的水平，說明葡萄糖與苯酚-硫酸能在較短時間內發生比較徹底的化學反應，生成物的量基本保持不變；為能保證化學反應完全，且便于實驗操作，故選取實驗反應時間為10min。

圖2 苯酚用量

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，對苯酚用量、濃硫酸用量、反應溫度三因素進行正交試驗，結果如表2所示。

表2 正交試驗結果

通過對R值的分析可知，RA＞RC＞RB，即各反應條件對OD490nm值的影響大小依次為苯酚用量＞反應溫度＞濃硫酸用量。從K值的分析中可知，較佳的反應條件為A2B2C2，即苯酚用量200μL，濃硫酸用量700μL，反應溫度80℃。

2.4 標準曲線繪制與檢測結果

以葡萄糖濃度為橫坐標，OD490nm值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示，得到回歸方程為y=0.0076x-0.01118，R2=0.9989，說明當葡萄糖濃度在 0～100μg/mL范圍內，酶標儀測定結果線性關系良好。

圖3 葡萄糖標準曲線

使用酶標儀測定不同濃度葡萄糖標準溶液的OD490nm值，并根據標準曲線計算出葡萄糖濃度，與已知濃度比較，結果如表3所示。從表中數據可以看，采用酶標儀測得的葡萄糖溶液的濃度與已知濃度非常接近，說明采用該方法測得的結果準確。

表3 酶標儀測得的葡萄糖溶液的濃度與已知濃度比較

3 結語

本研究以酶標儀代替紫外分光光度計，對苯酚-硫酸法測定多糖的反應條件進行優化，得出苯酚-硫酸法的最佳測定條件為：苯酚用量200μL、濃硫酸用量700μL、反應溫度80℃、反應時間10min，以該方法反應繪制得到的標準曲線R2可達0.9989，且能得到準確可靠的測定結果，為多糖快速批量測定方法的開發提供了新策略。