基于化學模式識別技術的枳實HPLC定量指紋圖譜研究

戚華文，徐 鑫，溫 柔，高德嵩，王超然， 劉艷芳，金紅利，梁鑫淼

(中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023)

枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破氣消積，化痰散痞的功效，常用于積滯內停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結胸、臟器下垂等癥狀[1]。枳實中含有黃酮苷類成分，主要為柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷等[2-4]。現在藥理學研究表明，枳實具有促進腸胃蠕動、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等藥理活性[5-7]。枳實藥材資源分布廣泛，主產于江西、湖南、四川等地，以江枳實(江西清江)、湘枳實(湖南沅江)等為道地藥材，并根據直徑進行枳實等級劃分，均以肉厚瓤小、質堅實、香氣濃者為佳。由于枳實產地廣泛且栽培品種繁多，市場上藥材質量差異較大[8]，藥典中枳實僅以辛弗林為含量測定及鑒別對象，并不能完全反映藥材的品質，因此建立一種簡單有效的分析方法對不同產地枳實進行質量評價顯得尤為重要。

指紋圖譜是鑒定中藥真?zhèn)巍⒃u價其質量一致性和穩(wěn)定性的可行性方法，通過光譜和色譜法獲得中藥的化學成分，具有信息量大、特征明顯、完整性和模糊性等特點[9-10]。中藥指紋圖譜可以反映出各種化學成分分布的整體狀態(tài),從而更全面地對中藥進行質量評價。本文采用高效液相色譜(HPLC)法對22批枳實藥材的指紋圖譜進行研究，并利用液相色譜-四極桿飛行時間質譜(HPLC-QTOF-MS)聯(lián)用技術鑒定共有峰的化學結構，同時結合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等化學計量學方法對其質量穩(wěn)定性進行研究，并探討枳實HPLC指紋圖譜共有模式在易混淆品枳殼中的鑒別應用，為枳實質量評價提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

表1 藥材樣品信息Table 1 Sample information of medicinal materials

高效液相色譜系統(tǒng)，包括2695梯度泵，2998二極管陣列檢測器，自動進樣器，柱恒溫系統(tǒng)，Empower色譜工作站(美國沃特世公司)；MS204TS電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，AB SCIEX X500系列QTOF質譜儀(美國AB SCIEX 公司)。Tnature-ACCHROM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世公司)、Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世公司)、Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國安捷倫公司)。

新橙皮苷(批號B21390，規(guī)格20 mg，純度98.0%)購自上海源葉生物科技有限公司。藥材：枳實藥材S1～S22共22批，采自江西劉公廟、湖南、福建等地；枳殼藥材Z1～Z5共5批，采自江西劉公廟，各批次藥材質量符合2020年版《中國藥典》，經中國科學院大連化學物理研究所楊小平鑒定，均為正品，具體信息見表1。乙腈、甲醇(4 L，色譜級，Sigma-Aldrich)；甲酸(500 mL，色譜級,Aladdin)。實驗室用水來自Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(Billerica,MA,USA)。

1.2 實驗條件

1.2.1 HPLC-DAD色譜條件色譜柱：Tnature-ACCHROM C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.5%甲酸溶液(B)，程序洗脫：0～10 min,5%～18%A；10～35 min,18%～27%A；35～40 min,27%～48%A；40～60 min,48%～95%A；60～65 min,95%A；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為320 nm。

1.2.2 HPLC-QTOF-MS質譜條件液相條件與上述相同。離子源：ESI 離子源；正離子模式；氣簾氣：241.3 kPa；Gas 1：379.2 kPa；Gas 2：379.2 kPa；溫度：550 ℃；離子化壓力：5 500 V，去簇電壓：80 V；全掃描范圍：m/z50～1 500；裂解電壓：40 V;CE Spread：20 V。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的制備取新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含新橙皮苷80 μg的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備取枳實藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間的相對標準偏差(RSD)均小于1%，主要特征峰的相對峰面積的RSD均小于5%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間的RSD均小于1%，主要特征峰的相對峰面積的RSD小于5%，表明供試品溶液在24 h內的穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復性取批號為S1的枳實藥材，制備6份供試品溶液，進樣，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間的RSD均小于1%，主要特征峰的相對峰面積的RSD小于5%，表明該方法的重復性良好。

2.2 耐用性試驗

2.2.1 色譜柱的影響取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，在相同色譜條件下，考察了規(guī)格均為250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm的Symmetry C18、Eclipse XDB-C18和Tnature C183根C18色譜柱對枳實特征圖譜的影響。結果顯示，在3根C18色譜柱上，枳實特征圖譜的色譜峰數目和分離度均無明顯差異。實驗最終選用Tnature C18色譜柱。

2.2.2 柱溫的影響取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，考察20、25、30、35、40 ℃等不同柱溫對枳實特征圖譜的影響。結果顯示，5種柱溫條件下特征圖譜的分離效果無明顯差異，各色譜峰的峰形和分離度均較好。表明不同柱溫對枳實藥材特征圖譜的影響較小，最終選擇柱溫為30 ℃。

2.2.3 不同流速的影響取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，考察了0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min等不同流速對枳實特征圖譜的影響。結果顯示，不同流速條件下，枳實特征圖譜的分離效果差異不大，實驗最終選擇流速為1.0 mL/min。

2.3 枳實指紋圖譜的建立

取22批(S1～S22)枳實藥材，按“1.3.2”制備枳實供試品溶液,按“1.2.1”依次進樣檢測，采集22批枳實的HPLC指紋圖譜(圖1)。將S1～S22批枳實樣品的色譜圖全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012版)，以S1批藥材的圖譜為校正參照，使用中位數進行自動匹配，加以多點校正，可識別12個共有色譜峰，得到枳實藥材的對照譜圖(圖2A)，選擇出峰時間穩(wěn)定且相對居中的新橙皮苷峰作為參比峰。根據色譜峰匹配結果進行相似度分析，得S1～S22指紋圖譜與共有模式對照指紋圖譜的相似度分別為1.000、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.998、0.998、0.999、0.998、0.962、0.937、0.955、0.965、0.946、0.950、0.930、0.922、0.973、0.954。相似度結果顯示，22批枳實藥材的相似度均在0.9以上，無法區(qū)分不同產區(qū)的枳實藥材。

2.4 指紋圖譜共有峰的指認

為明確枳實的物質基礎組成，本實驗采用HPLC-QTOF-MS對枳實中的化學成分進行較全面的定性分析，從而提高其質量控制水平。取批號為S1的枳實藥材，制備供試品溶液，按“1.2.2”的HPLC-QTOF-MS質譜條件進行質譜數據采集，通過比對精確相對分子質量和特征碎片離子，結合軟件推斷的分子式及文獻報道，鑒定出枳實11個共有峰，結果見表2。

2.5 聚類分析(CA)

以22批枳實指紋圖譜中12個共有峰峰面積為變量，導入SPSS 22.0軟件，采用組間均連法，選擇平方歐式距離為測度對其進行系統(tǒng)聚類分析。根據CA結果(圖3)，22批枳實樣品分為2類，其中來自江西產區(qū)的樣品S1～S12聚為一類，來自福建和湖南產區(qū)的樣品S13～S22聚為一類，表明福建與湖南產區(qū)的枳實指紋圖譜相似度較高。對3省產區(qū)的枳實性狀進行比較，結果表明，江西的枳實皮較厚、瓤囊較小，而湖南和福建兩個產區(qū)的枳實性狀相近，但與江西產區(qū)枳實的性狀差異顯著。因此，聚類分析結果與性狀鑒別結果一致。

圖1 22批枳實藥材的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 22 batches of Citrus aurantium

表2 枳實特征峰的鑒定Table 2 Identification of characteristic peaks of Citrus aurantium

圖3 22批枳實藥材的聚類分析樹狀圖
Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 22 batches ofCitrusaurantium

圖4 枳實藥材樣品的PCA分析得分圖Fig.4 PCA scores of Citrus aurantium samples

圖5 枳實藥材樣品的OPLS-DA分析得分圖Fig.5 OPLS-DA scores of Citrus aurantium samples

圖6 枳實樣品的變量載荷評價參數(VIP)值Fig.6 Variable load evaluation parameter(VIP) value of Citrus aurantium samples

2.6 主成分分析(PCA)

PCA是采用線性投影將原來的多個變量空間轉化成一組新的正交變量的統(tǒng)計分析方法，可實現高維數據的降維處理，少數幾個主成分即可代表原始數據的大部分信息[11]。本實驗采用SIMICA 14.1軟件，以22批次枳實樣品的共有峰峰面積為數據陣，對不同產區(qū)枳實藥材進行主成分分析。根據得分圖(圖4)可以看出，江西產區(qū)枳實聚為一類，福建和湖南產區(qū)聚為一類，不同產區(qū)的枳實樣品存在差異性，與聚類分析結果一致。由圖4還可以看出，產區(qū)為湖南的樣品S23離散度較大，說明同一產區(qū)樣品的內部差異性較大；而江西產區(qū)樣品分布較為集中，差異性較小。

2.7 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

為了更好地觀察樣品組間差異，采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型對22批枳實進行分析[12]，得分圖見圖5。由模型驗證參數可知，數據矩陣的結實率參數R2X=0.893，模型區(qū)分參數R2Y=0.99，模型預測參數Q2=0.973，表明建立的模型穩(wěn)定且有較強的預測能力。從圖5中可以看出，江西產區(qū)與其他產區(qū)(福建與湖南)的枳實在OPLS-DA 圖中呈現了各自的特定區(qū)域，分離效果明顯。

為進一步確認對樣品分類貢獻度較大的成分，采用變量載荷評價參數值(VIP)進行評價，該值可以體現變量對模型的整體貢獻水平。VIP 值越大，表明變量的貢獻程度越大，一般認為，VIP值大于1的化合物在兩組分類中發(fā)揮了重要作用[13]。本實驗篩選出對模型上2組間分類貢獻較大的3個變量(圖6)，影響大小依次為峰5(橙皮苷)、峰6(新橙皮苷)、峰4(柚皮苷)，說明可能是區(qū)分江西枳實與其他兩個產區(qū)(福建與湖南)枳實的質量差異性物質。

2.8 指紋圖譜的鑒別應用

枳實與枳殼均來源于蕓香科植物酸橙，其中枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck.的干燥幼果；枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，二者為同種藥材的不同時期，性狀比較相近，而功效和主治癥方面卻有很多不同[14]。本實驗取5批枳殼藥材(Z1～Z5)，按“1.3.2”制備枳殼供試品溶液,“1.2.1”進樣檢測，采集5批枳殼的HPLC指紋圖譜(圖2B)，并與枳實的HPLC指紋圖譜(圖2A)進行比較。結果顯示，枳殼與枳實指紋圖譜在成分比例上存在較大差異，經過中藥指紋圖譜相似度軟件處理兩個品種相似度為0.68，該方法所建立的指紋圖譜可用于二者的鑒別。

2.9 枳實含量的測定

表3 3個指標成分的線性關系及線性方程Table 3 Linear relationships and linear ranges of three components

2.9.1 線性關系精密吸取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品儲備液適量，配制成7個質量濃度系列的混合對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件進行測定，以各對照品的質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程、相關系數(r2)和線性范圍(見表3)。各化合物在一定質量濃度范圍內的線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.999。

2.9.2 精密度、穩(wěn)定性與重復性取同一批次枳實樣品粉末(批號S1)，按“1.3.2”方法制備，稀釋10倍后按照“1.2.1”色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6針，計算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質量分數分別為6.83%、2.72%、18.19%，RSD分別為0.54%、0.4%、0.4%。表明儀器精密度良好。

取同一批次枳實樣品粉末(批號S1)，經上述樣品前處理后，稀釋10倍后分別于0、6、12、18、24 h進行測定，計算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質量分數分別為6.85%、2.74%、18.26%，RSD 分別為0.6%、1.3%、0.6%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

取同一枳實樣品粉末6 份(批號S1)，經上述樣品前處理后，稀釋10倍后進行測定，計算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均質量分數分別為6.73%、2.66%、17.92%，RSD 分別為0.8%、1.7%、1.1%。表明方法重復性良好。

2.9.3 回收率試驗精密稱取枳實粉末6 份(批號S1)，每份約0.05 g，置于100 mL容量瓶中，分別加入柚皮苷3.78 mg、橙皮苷1.67 mg、新橙皮苷9.84 mg，精密加入甲醇，定容至100 mL，后續(xù)處理同“1.3.2”。按照“1.2.1”色譜條件測定，結果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為100%、92.5%、101%，RSD分別為1.3%、2.6%、1.1%。

2.9.4 含量測定通過對22 批枳實藥材進行分析，測定枳實中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，測定結果見表4。結果顯示，江西產區(qū)枳實的指標成分含量范圍為：柚皮苷6.51%～8.35%、橙皮苷2.23%～4.15%、新橙皮苷16.92%～18.91%；湖南產區(qū)枳實：柚皮苷5.54%～5.87%、橙皮苷7.84%～9.81%、新橙皮苷14.22%～16.52%；福建產區(qū)枳實：柚皮苷4.81%～5.91%、橙皮苷7.23%～9.73%、新橙皮苷13.27%～15.71%。其中，湖南和福建產區(qū)的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量接近，但二者與江西產區(qū)存在一定差異。

表4 枳實中3種組分的定量分析Table 4 The quantitative result 3 of three components in Citrus aurantium (%)

(續(xù)表4)

3 結 論

本文對22批不同產區(qū)枳實藥材進行了研究，建立了枳實藥材的定量指紋圖譜，標定了12個共有峰，并通過HPLC-QTOF-MS指認出11個成分。采用中藥指紋圖譜相似度軟件對22批枳實樣品的指紋圖譜進行評價，相似度均大于0.9，但無法確定不同產地差異性。因此，在指紋圖譜的基礎上，通過CA、 PCA 和 OPLS-DA對3個產區(qū)枳實藥材進行了區(qū)分。結果顯示，3種化學計量學結果較為一致：江西產區(qū)枳實藥材聚為一類，福建和湖南產區(qū)枳實聚為一類；進一步采用VIP值法進行分析，篩選出橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷為差異性質量標志物。此外，采用同一分析方法對5批易混淆品枳殼進行分析，其指紋圖譜與枳實差異較大，可用于二者的鑒別。本文建立的枳實HPLC指紋圖譜，方法簡單、可靠，可較為全面的反應枳實化學信息，結合CA、 PCA 和 OPLS-DA對指紋圖譜進行綜合評價，使結果更為全面科學，可用于枳實藥材的質量控制。