HPLC法測定人血清中阿米卡星的濃度及臨床應用

徐蘭，汪鳳華，任琦，陳集志，李剛*

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○八醫院藥學科，南昌 330002；2.南昌大學第四附屬醫院，南昌 330003；3.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029

阿米卡星是一種半合成氨基糖苷類抗生素，常被經驗性聯合青霉素類或β-內酰胺類抗菌藥物用于治療Gˉ多重耐藥菌感染，且不會被普通細菌酶和低耐藥性細菌所激活［1］，臨床上常用于呼吸道感染、骨關節感染、敗血癥、中樞神經系統感染、手術后感染及復發性尿路感染等［2］。但由于其具有嚴重的不良反應如腎毒性、聽力損害［3］，因而使用劑量較小且臨床療效差，特別是在重癥多重耐藥菌感染時使用阿米卡星非常謹慎。阿米卡星具有濃度依賴性，血漿峰濃度/細菌MIC的比值是評價抗菌活性的最好參數［4］，更高的峰濃度可以獲得更為理想的治療效果［5,6］，臨床上需對于ICU重癥感染患者給予高于常規劑量的阿米卡星。因此，對重癥感染患者需進行血藥濃度監測，按血藥濃度監測結果及時調整給藥方案，減少耐藥菌株的產生，提高治療成功率。

目前關于阿米卡星的血清濃度測定包括微生物 法［7］、熒光偏振免疫法［8］、HPLC-UV法［9］、HPLC-MS/MS法［2，10］等，但考慮到柱前或柱后衍生化法、固相萃取法操作繁瑣，測定結果容易受衍生化試劑及衍生化產物穩定性的影響，微生物法準確度欠佳，而普通醫院無法配備價格昂貴的液質聯用儀，均無法快速有效進行阿米卡星血清濃度監測。本試驗參考相關文獻，采用HPLC-末端吸收法，對血樣處理方法、色譜條件進行優化調整，建立了一種準確度高、快速、簡便、重現性好的HPLC法測定人血清中阿米卡星濃度，并應用于本院血藥濃度監測，為臨床醫師安全合理使用阿米卡星提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-15C型高效液相色譜儀（包括SPD-15C二極管陣列檢測器，LC-15C泵，CTO-15C柱溫箱，SIL-10AF自動進樣器）；AZJ-2002-C型超純水儀（美國艾科浦國際有限公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D型1/10萬電子分析天平（日本島津公司）；TG1650-WS型高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；微量移液器（Thermo Fisher科技有限公司）。阿米卡星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130335-200204，每mg相當于655單位）；辛烷磺酸鈉（上海藍季科技發展有限公司，批號：110910，分析純）；無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀（西隴科學股份有限公司，分析純）；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［11］色譜柱為Wondasil C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；預柱為C18保護柱（3.0 mm×4 mm，迪馬科技公司）；流動相：辛烷磺酸鈉1.8 g和無水硫酸鈉20 g，加pH 3.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用0.2 mol/L磷酸溶液調節pH值至3.0）50 mL和乙腈75 mL溶解，用水稀釋至1 000 mL；流速為1.3 mL/min；檢測波長為200 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為20 μL。

2.2 對照品溶液的配制精密稱取阿米卡星對照品0.023 6 g，置25 mL量瓶中，加注射用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.944 0 mg/mL的阿米卡星對照品溶液，分裝于1.5 mL EP管中，置-20 ℃冰箱保存，備用。

2.3 樣品處理密量取血漿樣品200 μL，加入10%高氯酸溶液50 μL，渦旋振蕩2 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后，進樣分析。

2.4 專屬性試驗按“2.1”項下色譜條件測定，進樣分析，色譜圖見圖1。由結果可知，經甲醇、乙腈、正己烷萃取的血樣，阿米卡星保留時間處無峰或者峰面積非常小，提取回收率非常低，不適合阿米卡星血樣處理。經10%高氯酸萃取的阿米卡星血樣，色譜峰形較好，保留時間約為9.8 min，12 min左右有一雜質峰，但不干擾阿米卡星峰型，分離度大于1.5，且血清中其他內源性雜質對阿米卡星無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 標準曲線的繪制取濃度為0.944 0 mg/mL的阿米卡星對照品溶液適量，加入超純水稀釋并配制成濃度分別為472.84、236.44、118.21、59.12、29.56、9.84、4.92、2.48 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取空白血清150 μL，置1.5 mL離心管中，加入阿米卡星系列對照品溶液50 μL，使阿米卡星血清濃度分別為0.62、1.23、2.46、7.39、14.78、29.55、59.11、118.21 μg/mL，按“2.3”項下方法處理，進樣分析，記錄色譜圖。以血清濃度（C，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得阿米卡星的回歸方程為Y=7 013.8C-6 242，r=0.999 8。定量下限濃度為0.62 μg/mL。結果表明，阿米卡星血清濃度在0.62～118.21 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 回收率試驗分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對照品血清樣品，每個濃度樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積代入回歸方程計算得出各濃度的測定值，與加入濃度比較，計算方法回收率。分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對照品血清樣品及水溶液，每個濃度樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，進樣分析，記錄峰面積分別為A1、A2。絕對回收率=（血清樣品峰面積/水溶液峰面積）×100%=（A1/A2）×100%。結果見表1，說明該方法符合生物樣品分析要求。

表1 回收率試驗結果（±s，n=5）

表1 回收率試驗結果（±s，n=5）

2.7 精密度試驗分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對照血清樣品，每個濃度樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，進行分析，測定日內5次及日間5次的精密度，結果阿米卡星的日內和日間精密度RSD均＜10%，該方法符合生物樣品分析要求。

2.8 穩定性試驗分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對照血清樣品，每個濃度樣品各3份，按“2.3”項下方法處理，分別考察在室溫穩定性、冷藏穩定性、凍融穩定性。室溫穩定性：室溫放置0、2、4、6、8、12 h；冷藏穩定性：4 ℃、-20 ℃冰箱分別冷藏放置24 h；凍融穩定性：-20 ℃冰箱中凍存，取出自室溫自然融化，再置-20 ℃冷凍24 h，此步驟重復2次，共進行3次凍融試驗。以上樣品均按“2.3”項下方法處理，進樣分析，結果見表2，阿米卡星峰面積均變化不大（峰面積變化＜15%，RSD＜6.26%），說明阿米卡星血清樣品在室溫、冷藏、凍融條件下均比較穩定。

表2 血清樣品阿米卡星的穩定性（±s，n=5）

表2 血清樣品阿米卡星的穩定性（±s，n=5）

3 治療藥物監測

收集2019年6月至2020年6月我院ICU住院的重癥感染患者16例，患者因治療需要聯合青霉素類或β-內酰胺類抗菌藥物用于治療革蘭陰性多重耐藥菌感染。給藥方案為0.4 g加入250 mL 0.9%氯化鈉注射液中靜脈滴注，q12 h。在用藥48～72 h血藥濃度達穩態后，經外周靜脈采血，谷濃度在阿米卡星靜滴前30 min采血，峰濃度在阿米卡星靜滴完畢后30 min采血。本試驗方案經本院倫理委員會批準通過。共收集患者血清36例，測定結果為峰濃度 在21.35～43.18 μg/mL［（31.56±4.73）μg/mL］，有6例樣品濃度低于定量下限，其余樣本谷濃度在1.05～8.59 μg/mL［（4.36±1.13）μg/mL］。

4 討論

本試驗比較了10%高氯酸、甲醇、乙腈、正己烷等幾種蛋白沉淀劑對血漿樣品分離效果的影響。經甲醇處理的樣品，靜置后進樣瓶底部有白色沉淀物，且阿米卡星提取回收率較低，僅有25%左右，不能滿足定量下限的要求；經乙腈處理的樣品，阿米卡星保留時間處無色譜峰出現，這與張亮［9］采用乙腈進行萃取的結果不一致，分析原因可能與色譜柱、高效液相色譜儀型號不一致或者流動相選擇不同有關。而經正己烷提取后的血漿中雜質峰較多，干擾阿米卡星峰；經10%高氯酸沉淀蛋白后，阿米卡星提取回收率達90%左右，且干擾峰較少，能減少血清中雜質干擾，故選擇10%高氯酸作為蛋白沉淀試劑。對10%高氯酸的用量（20 μL、50 μL）進行考察，20 μL用量沉淀后的血樣較渾濁，雖然提取回收率較高（達96%），但靜置后底部仍有白色沉淀物，沉淀效果欠佳；50 μL用量處理的血樣，上清液靜置24 h后仍澄清，且色譜圖干擾峰較少，提取回收率滿意。

由監測結果可知，不同患者的谷、峰濃度差異比較大，其中6例患者谷濃度低于定量下限。阿米卡星檢測波長為200 nm，屬于末端吸收，靈敏度較低，定量下限為0.62 μg/mL。部分患者阿米卡星在體內的代謝及清除較快，給藥后24 h內排泄90%以上，體內藥物濃度低于0.62 μg/mL，本方法無法檢測到。阿米卡星血清濃度個體化差異較大，分析原因可能與ICU重癥感染患者存在影響藥物體內分布和排泄的多種因素有關，比如高齡、低蛋白血癥、肝腎功能損傷等，這些病理生理變化都會造成藥物在體內過程發生改變，分布容積增大、藥物稀釋、清除增加等。而且阿米卡星主要經腎小球濾過排泄，各器官功能的下降也可引起藥物代謝及清除下降，ICU重癥感染患者腎功能差異較明顯。這些原因都會造成阿米卡星在重癥患者體內濃度存在一定的個體化差異。

阿米卡星具有耳毒性和腎毒性，因此非常有必要通過優化抗菌藥物治療方案，嚴密監測患者血清濃度（谷濃度＞5 μg/mL為毒性閾值）。因本研究測定病例數較少，下一步研究方案擬擴大樣本測定量，并監測患者腎功能、聽力，將阿米卡星的血清濃度與抗菌效果、不良反應有效結合起來，提高抗感染治療效果的同時避免阿米卡星引起的不良反應，得到優化的、個體化的給藥方案應用于臨床，促進抗菌藥物的持續質量改進，為藥學同行提供參考依據。