合并隱匿性胰膽反流的膽囊結石電鏡微觀結構觀察

張思淼，劉飛，劉波，祁春春，史力軍，李婧伊，馬躍峰，楊玉龍，劉文志

（大連大學附屬中山醫院，遼寧 大連 116001，1.膽石病微創外科，3.胃腸外科；2.同濟大學附屬東方醫院膽石中心，上海 200120）

膽囊結石是一種常見病、多發病，其發病原因與多種因素有關，隨著膽胰共同流出道理論的提出，隱匿性胰膽反流（occult pancreaticobiliary reflux，OPBR）被認為是膽囊結石形成的重要原因[1-2]。OPBR是指在正常膽胰管合流的情況下發生的胰液向膽管反流[3]。在良性膽囊疾病中，OPBR的發生率為25.8%～84.2%[4]，且83.5%的膽囊結石存在OPBR[5]。目前認為，膽汁淀粉酶是反映胰液向膽管反流的客觀指標[6]，與膽囊結石的形成密切相關[7]。本研究從微觀結構的角度推測膽囊結石形成過程，探索OPBR的成石機制，為臨床防治膽囊結石提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年9月至2020年5月大連大學附屬中山醫院膽石病微創外科行腹腔鏡膽囊切除術（laparoscopic cholecystectomy，LC）治療的139例膽囊結石患者臨床資料，所有患者術前MRCP均顯示膽胰管匯合部無解剖異常，血清淀粉酶正常。本研究獲倫理委員會批準。

病例納入標準：（1）血清淀粉酶正常；（2）MRCP顯示膽胰管合流正常；（3）行LC治療的膽囊結石患者。排除標準：（1）急慢性胰腺炎；（2）合并肝臟疾病（脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等）；（3）單純泥沙樣膽囊結石；（4）膽囊頸管內結石；（5）肝內膽管結石；（6）醫源性操作導致Oddi括約肌異常或曾經接受過ERCP治療（如曾行腸膽吻合術，內鏡下十二指腸括約肌切開取石術或內鏡下胰膽分流術）；（7）合并膽胰匯合部疾病以外的其他肝膽胰疾病（如肝膽部腫瘤、膽囊腺肌增生癥、肝外膽管狹窄或擴張等）。

1.2 研究方法

1.2.1 膽汁及結石收集：經腹腔鏡建立人工氣腹，暴露膽囊三角后，在膽囊底部用穿刺針抽取膽囊膽汁5 mL，置入普通真空試管并在30 min內送檢膽汁淀粉酶，測量膽汁淀粉酶水平，其余操作同LC常規。術后取出膽囊內的結石。

1.2.2 結石觀察：用刀片切開結石，對結石橫切面及表面進行清潔、固定、干燥后，用雙面導電膠固定在電鏡樣品臺上，在鍍膜儀（英國Quorum公司Q150T濺射鍍膜儀）中真空噴金鍍膜后，通過掃描電鏡（美國Quanta公司Quanta450型掃描電子顯微鏡）對結石橫切面進行觀察。

1.3 評價標準

（1）膽汁淀粉酶濃度升高：高于血清淀粉酶正常值上限（110 U/L）[8]。

（2）正常胰膽合流：MRCP顯示主胰管與膽總管在十二指腸壁內匯合。

（3）隱匿性胰膽反流（OPBR）：MRCP顯示為胰膽合流正常，血清淀粉酶正常，膽汁淀粉酶濃度＞110 U/L。

（4）膽囊結石微觀特征：筆者團隊在大連理工大學化工實驗室幫助下，結合化工材料學的概念，對膽囊結石的微觀結構特征制定如下評價標準。晶粒：構成結石晶體的大小、形態各異的小晶體。電鏡下見板片狀、顆粒狀等。晶界：晶粒間的輪廓邊界。晶粒堆砌相對緊密（圖1）：微觀晶體呈整塊狀或類整塊狀分布，周圍可見大量類球形顆粒，再細分為兩種：①整塊狀：晶粒排列致密規整融合成塊，可見部分裂紋，不見晶粒及晶界（圖1A）；②類整塊狀：晶粒間填充物增多，晶界不清，部分晶粒連接成塊（圖1B）。晶粒堆砌相對疏松（圖2）：晶界清晰，晶粒間有較大空隙，填充物較少，只見少量類球形顆粒。

1.4 統計學分析

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析處理。計量資料符合正態分布，以（±s）表示，組間比較用t檢驗；計數資料以[例（%）]表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較

依據膽囊膽汁淀粉酶水平，將98例膽汁淀粉酶濃度升高者（＞110 U/L）作為OPBR組，41例膽汁淀粉酶濃度正常者作為對照組。兩組年齡、性別、結石數量、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。

表1 兩組基線資料比較

2.2 電鏡下膽囊結石微觀結構特征

兩組結石晶粒堆砌相對緊密型和相對疏松型在兩組中均存在，故對兩組結石微觀結構特征不作分組介紹。電鏡下觀察兩組膽囊結石由大量形態、大小各異的晶粒堆砌而成，如板片狀、顆粒狀晶粒等，周圍可見類球形顆粒。板片狀晶粒可呈層狀、放射狀、條索狀、不規則交錯的疏松排列（圖2A），甚至晶粒間通過某些填充物進而融合成整塊狀（圖1A）或類整塊狀（圖1B1、B2）。整塊狀堆砌呈現晶粒排列致密規整融合成塊，可見部分裂紋，不見晶粒及晶界（圖1A）；類整塊狀堆砌呈現晶粒間填充物增多，晶界不清，部分晶粒連接成塊（圖1B1、B2）。顆粒狀晶粒呈疏松的類球形（圖2B），甚至可見毛刺球形的類整塊狀分布（圖1B3）。以上特征均在兩組中出現。

圖1 晶粒堆砌相對緊密型的膽囊結石微觀結構

圖2 晶粒堆砌相對疏松型的膽囊結石微觀結構

2.3 兩組電鏡下結石微觀結構比較

OPBR組98例中64例結石晶粒間填充物增多，微觀晶體呈整塊狀或類整塊狀分布，周圍見大量類球形顆粒，表現為相對緊密型；34例結石晶粒間填充物較少，有較大空隙，晶界清晰，周圍只見少量類球形顆粒，表現為相對疏松型。對照組41例中18例呈相對緊密型，23例呈相對疏松型。OPBR組膽囊結石晶粒堆砌緊密程度較高，且結石為相對緊密型的比率高于對照組[65.3%（64/98）vs43.9%（18/41），χ2=5.474，P＜0.05]，差異有統計學意義。

3 討論

膽囊結石具有晶體特征，是膽汁中多種成分在復雜因素影響下相互作用的結果。隨著研究深入，學者們普遍認為膽囊結石是因某種因素打破膽汁中膽固醇、磷脂、膽汁酸三者之間濃度平衡，甚至破壞了促、抗成核因子的動態平衡，膽固醇聚集結晶，膽汁內出現晶核[9-11]，每個晶核在細菌、自由基、離子等眾多復雜理化因素的影響下，逐漸成長為形態及大小各異的晶粒。本研究中，膽囊結石晶粒有板片狀、顆粒狀、針桿狀等。喬鐵等[12]發現，晶粒間的縫隙存在一定數量的類球形顆粒（為膽紅素顆粒）。有研究表明，膽囊結石是由一定數量的晶粒通過非晶物質填充進而堆積而成[13]，此填充物主要由蛋白質和膽紅素鹽組成[14]。多數研究者認為，膽囊結石的晶體結構較疏松且易破壞，這是采用體外振波碎石的結構基礎[15]。因此，我們大膽推測，因眾多復雜病理因素致膽汁內促、抗成核因子等某些動態平衡被打破，膽汁中晶核出現，晶粒逐漸長出；膽囊內復雜多變的環境限制晶粒進一步生長，所以晶粒主要通過蛋白質網架及具有促成核作用的膽紅素鹽作為填充物，相對疏松地堆砌成多核生長的結石晶體。

本研究中，OPBR組中整塊狀或類整塊狀結構比率較對照組高，我們推測胰液中大多數酶是以酶原形式存在的，反流入膽管內的酶原被膽汁激活后可引起較嚴重的生化破壞，如：膽固醇酯水解酶及磷脂酶A2被激活后，可分別水解膽固醇酯和卵磷脂，其產物中均有脂肪酸，可與鈣離子結合成脂肪酸鈣鹽，形成結石晶體的晶核[16]；同時，激活的磷脂酶A2在分解卵磷脂后可產生有細胞毒性的溶血磷脂酰膽堿，這使膽汁中卵磷脂、膽固醇及膽鹽比例失衡，膽固醇溶解度降低而析出[17]。此外，這些激活的酶及其代謝產物可引起膽囊黏膜損傷并產生更嚴重的慢性炎癥改變[18]，膽囊黏膜損傷影響其對水和離子的重吸收，使膽汁內黏蛋白及白蛋白等濃縮[19]，慢性的炎癥刺激使膽囊黏膜上皮細胞分泌大量黏蛋白，這為膽固醇沉積提供了結石網架[20]。動物實驗研究發現，取石后的膽囊黏膜分泌黏液增加，其黏液中糖蛋白先形成框架，使沉積其上的膽色素和膽固醇結晶成為微小結石，是取石術后復發的重要原因[21]。由此可見，OPBR可導致膽汁內黏蛋白的大量分泌與濃縮，作為促成核因子的膽紅素鈣鹽聚集沉淀，兩者正是膽囊結石晶粒間填充物的主要成分，它們共同構成結石晶粒堆砌的連接與網架。還有研究發現對于膽囊底部的微小結石和膽泥，可影響膽囊的收縮功能及其對膽道壓力的調節，使膽道壓力逐步降低[22]，且膽囊排出的微小結石及膽泥可間歇性阻塞膽胰共同流出道，從而加重高壓的胰液反流入膽管[6]。膽囊結石與OPBR之間相互影響，促進結石形成與進一步生長。

膽道外科屬于腔道外科，通暢與否是分析問題的原則。研究發現，由于膽胰隔膜缺失或Oddi括約肌功能失調，乳頭炎等膽胰匯合部疾病隨之發生[2]。此疾病可引起膽胰共同流出道不暢，高壓的胰液反流至膽管，進而發生OPBR，且淤積的膽汁胰液使膽道壓力升高。這一系列病理生理改變成為膽囊炎伴結石等多種膽道疾病發生的重要原因[23]。由此可見，膽道疾病多為膽胰匯合部疾病的表現形式[1]。由于膽胰共同通道過長為OPBR的獨立危險因素[24]，目前對于存在膽胰匯合部疾病的OPBR患者，臨床可經十二指腸鏡行內鏡下胰膽分流術（endoscopic pancreaticobiliary separation，EPBS）[25]，剖開乳頭括約肌而非Oddi括約肌，維持膽道密閉性，通過縮短膽胰共同流出道來解除流出道梗阻[26]。EPBS可有效減少取石術后結石的復發，并降低膽囊切除術后綜合征的發生率[2，6，27]。我們可通過掃描電鏡觀察被取出的結石，細化EPBS手術指征，對診斷OPBR、開展針對患者結石成因的個體化治療具有重要輔助意義。

本研究將未行ERCP、EST、膽腸吻合等術式的膽囊結石患者作為研究對象，以排除腸膽反流對研究結果的影響。取樣時發現，取出的膽汁含大量泥沙樣結石的樣本，通常膽汁淀粉酶濃度較高，病程較長。此發現與上述隱匿性胰膽反流成石機制相符。本研究中兩組結石均出現晶粒堆砌相對緊密與疏松的結構特征，這可能與膽道壓力、病程等其他尚不明確的因素有關，需逐步深入探索。OPBR組內，即使是排列疏松的晶粒，其邊緣也大多可見絮狀物附著，高度懷疑其主要成分是蛋白質，需進一步驗證。目前研究表明，OPBR可表現為膽汁淀粉酶濃度升高和（或）膽道壓力的升高[7]，關于膽道壓力對結石微觀形態的影響度仍需探索。若通過紅外光譜從成分的角度探索合并OPBR的膽囊結石特征，能否進一步得到啟發并驗證或部分驗證本研究的推測，仍需不斷深入研究。

綜上所述，當OPBR發生時，晶粒間填充物增多、膽囊結石與OPBR間相輔相成的惡性循環，使晶粒彼此聚集更加結實、緊密，進而使膽囊結石晶體呈整塊狀或類整塊狀分布。本研究分析結石微觀結構，探索OPBR成石機制，可為膽胰匯合部疾病及取石術后結石復發提供理論依據，對臨床通過EPBS等個體化治療方式處理結石原發病有重要參考價值。此結果仍需結合紅外光譜、X射線能譜、多中心、大樣本及動物實驗進一步研究證實。

致謝：衷心感謝大連理工大學化工學院王同華教授及其團隊對本研究的技術支持與指導。