miR-135a靶向PTEN促進宮頸癌細胞增殖、凋亡和轉移能力的機制研究

黃天舒,裴麗鵬

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，2018年發病率為3.2%，是20～39歲女性腫瘤相關死亡的第二大原因[1-2]。在宮頸癌早期患者行手術切除治療，但是影響了年輕女性患者的生育能力，使得患者的生存質量和生命健康大打折扣。晚期或復發性宮頸癌的可用治療方法卻有限，放療和化療引起的毒副反應通常會嚴重影響患者的生活質量，且目前基本無法治愈[3]。雖然有效的巴氏涂片篩查技術提高了宮頸癌患者的診斷率，以及CryoPen和熱凝等技術已改善了宮頸癌的預防，但每年發生的宮頸癌病例數量仍然不斷增加[4-5]。因此急需開辟宮頸癌新的治療策略。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發病的高危因素[6]，但是HPV感染的細胞發展為腫瘤細胞還需要其他的因素[7]。研究報道，HPV可誘導微小RNA-135a(microRNA-135a, miR-135a)的表達以促進宮頸癌的轉化和進展，與癌前病變相比，miR-135a在惡性宮頸鱗狀細胞癌中過表達[8]。miR-135a可能是宮頸癌癌變過程中發揮重要作用的miRNA。miRNA通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)結合發揮其調控作用[9]，因此本研究通過分析miR-135a調控的靶基因研究miR-135a在宮頸癌中發揮重要作用的分子機制，獲得miR-135a作為宮頸癌治療候選靶點的依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑和材料 宮頸癌細胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細胞H8(中國上海細胞庫)，培養基、FBS和胰酶(美國Giboc公司)，Trizol試劑(日本TaKaRa公司)，Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒(上海DBI? Bioscience公司)，OneStep RT-PCR Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)，miR-135a、PTEN、內參U6和GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，pGLO-PTEN-野生型質粒(PTEN-wt)、pGLO-PTEN-突變型質粒(PTEN-mut)購自上海吉凱公司；雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒(英國Abcam公司)，miR-135a inhibitor和PTEN siRNA(廣州瑞博生物技術有限公司)，MTt試劑(上海碧云天生物試劑有限公司)，流式細胞儀(南京凱基生物技術有限公司)，Transwell小室(美國millipore公司)，RIPA(北京索萊寶試劑有限公司)，BCA(美國Thermo公司)，Akt、pAkt、mTOR和pmTOR抗體(美國proteintech公司)。

1.2細胞培養 將液氮中取出的宮頸癌細胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細胞H8復蘇后立即重懸至含有10% FBS的培養基中。C33A細胞培養基為MEM、Caski細胞培養基為RPMI1640、HeLa細胞培養基為DMEM-高糖，H8細胞培養基為DMEM-F12。細胞培養在37℃、5%CO2、全濕度培養箱中。細胞隔天更換一次培養基，細胞長滿時，PBS洗1次，胰酶消化細胞，進行細胞傳代。

1.3qRT-PCR C33A、Caski、HeLa和H8細胞長滿后，PBS洗1次，棄掉PBS后加入Trizol試劑，冰上裂解10 min后移至EP管中，加入氯仿混勻后離心，吸取上層上清液移至新的EP管中加入異丙醇混勻后離心，棄掉液體后加入乙醇洗1次，棄掉乙醇后加入無RNA酶雙蒸水溶解RNA，測得RNA的濃度。采用Bestar 1st Strand cDNA試劑盒，按照85℃ 5 s，37℃ 15 min反應條件將RNA逆轉錄為cDNA。采用RT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，95℃預變性5 s，95℃變性5 s、65℃退火延伸34 s，變性和退火延伸循環40個后測得各樣品的循環閾值(threshold cvcle， Ct)，按照2-ΔΔCt公式以U6為內參計算宮頸癌細胞和永生化宮頸上皮細胞中miR-135a的相對表達量，以GAPDH為內參計算宮頸癌細胞和永生化宮頸上皮細胞中十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)mRNA的相對表達量。miR-135a引物序列F:5′-GCCTCGCTGTTCTCTATGG-3′,R:5′-TGTCCCCGCCGTGCG-3′。PTEN引物序列F:5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′,R:5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′。U6引物序列F:5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′,R:5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。GAPDH引物序列F:5′-GTGAACCATGAGAAGTATG-3′,R:5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.4細胞轉染 miR-135a表達較高的宮頸癌細胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細胞計數，以1×105個細胞接種至6孔板中，分為NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組。細胞接種12 h后采用Lip2000進行小分子化合物轉染，無關序列轉染NC組細胞，miR-135a抑制劑(inhibitor)轉染miR-135a inhibitor組細胞，miR-135a inhibitor和PTEN siRNA同時轉染miR-135a inhibitor+si-PTEN組細胞，放至培養箱中培養，12 h更換新鮮培養基后繼續培養，轉染48 h后采用qRT-PCR檢測各組轉染效果。

1.5驗證miR-135a靶向調控PTEN TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-135a可能的靶基因。miR-135a表達較高的宮頸癌細胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細胞計數，以每孔2000個接種到96孔板中，分為NC+PTEN-wt組(無關序列與PTEN-wt同時轉染)；miR-135a+PTEN-wt組(miR-135a inhibitor與PTEN-wt同時轉染)；NC+PTEN-mut組(無關序列與PTEN-mut同時轉染)；miR-135a+PTEN-mut組(miR-135a inhibitor與PTEN-mut同時轉染)，收集轉染48 h的各組細胞，采用雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。qRT-PCR檢測NC和miR-135a inhibitor組細胞中PTEN mRNA的表達。

1.6MTT實驗 miR-135a表達較高的宮頸癌細胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細胞計數，以每孔1500個細胞接種到96孔板中，分為NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組，進行各組細胞的轉染。在細胞轉染0、24、48和72 h時，每孔加入20 μl MTT試劑，在培養箱中繼續孵育4 h，吸去培養基后每孔加入150 μl DMSO試劑。酶標儀檢測各樣品在490 nm處的吸光度(OD)值。

1.7凋亡實驗 各組細胞轉染48 h后，PBS洗1次后，采用無EDTA的胰酶消化收集各組細胞，PBS洗2次后，各孔加入500 μl的凋亡染色緩沖液重懸細胞，依次加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC染色常溫避光孵育進行細胞染色，15 min后流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.8Transwell實驗 各組細胞轉染48 h后，PBS洗1次后，采用胰酶消化收集各組細胞，PBS洗2次后細胞計數，1×105個細胞加入到100 μl無血清培養基中混勻，加入到Transwell小室的上室底部，下室加入含有10% FBS的完全培養基中。放置培養箱中培養10 h后終止培養，未穿過的細胞采用PBS洗去后，采用甲醇固定10 min、吉姆薩染色5 min，干燥后顯微鏡下拍照計數穿膜的細胞個數。

1.9Western blot檢測蛋白表達 各組細胞轉染48 h后，PBS洗1次，棄掉PBS后加入RIPA試劑，冰上裂解10 min后移至EP管中，超聲震蕩20 min后低溫14 000 r/min離心30 min，獲得蛋白裂解液。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液煮沸后制備變性蛋白。50 μg蛋白加入SDS-PAGE膠中電泳進行蛋白分離，濕性轉膜方法將蛋白轉移至PVDF膜上，8%脫脂牛奶孵育PVDF膜1 h封閉非特異性蛋白，一抗稀釋液Akt、pAkt、mTOR、pmTOR和內參GAPDH 4℃孵育過夜，抗稀釋液室溫孵育1 h，ECL化學發光法曝光蛋白條帶。

2 結果

2.1miR-135a和PTEN在宮頸癌細胞中的表達水平 qRT-PCR檢測miR-135a和PTEN分別在宮頸癌細胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細胞H8中的表達水平。miR-135a在宮頸癌細胞C33A、Caski、HeLa中的表達水平高于永生化宮頸上皮細胞H8，且Caski、HeLa高于C33A，HeLa低于Caski(P<0.05);PTEN mRNA在宮頸癌細胞C33A、Caski、HeLa中的表達水平低于永生化宮頸上皮細胞H8，且Caski、HeLa低于C33A，HeLa高于Caski(P<0.05)。見表1。選擇miR-135a表達水平較高的宮頸癌細胞Caski進行后續實驗。

表1 miR-135a和PTEN在宮頸癌細胞中的表達水平

2.2miR-135a對PTEN的靶向調控作用 TargetScan7.1軟件在線預測顯示PTEN啟動子區與miR-135a具有結合位點，見圖1。雙熒光素酶報道基因試驗結果顯示，NC+PTEN-wt組、miR-135a+PTEN-wt組、NC+PTEN-mut組、miR-135a+PTEN-mut組熒光素酶活性分別為1.00±0.03、2.51±0.12、1.00±0.04、1.08±0.09。與NC+PTEN-wt組相比，miR-135a+PTEN-wt組熒光素酶活性增加(P<0.01)；NC+PTEN-mut組與miR-135a+PTEN-mut組熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。提示miR-135a可靶向調控PTEN。

圖1 PTEN啟動子區與miR-135a的結合位點PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.3細胞轉染效率 選擇miR-135a表達較高的宮頸癌細胞Caski進行miR-135a inhibitor和PTEN siRNA的轉染，qRT-PCR檢測結果顯示：與NC組相比，miR-135a inhibitor組中miR-135a的表達降低(P<0.01)。表明miR-135a inhibitor成功轉染宮頸癌細胞。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組PTEN mRNA表達增加(P<0.05)。表明miR-135a負調控PTEN mRNA的表達。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組中PTEN mRNA表達降低(P<0.01)。表明PTEN siRNA成功轉染宮頸癌細胞。見表2。

表2 3組宮頸癌細胞Caski轉染效率比較

2.4miR-135a調控PTEN對宮頸癌細胞增殖能力的影響 MTT實驗檢測結果顯示，與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞增殖能力降低。而與miR-135a inhibitor 組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞增殖能力增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細胞增殖能力的抑制作用。見圖2。

圖2 miR-135a調控PTEN對Caski細胞增殖能力的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物,OD為吸光度；與NC組比較，aP<0.05；與miR-135a inhibitor組，cP<0.05

2.5miR-135a調控PTEN對宮頸癌細胞凋亡的影響 流式細胞學檢測結果顯示，NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞凋亡率分別為(2.03±0.21)%、(14.96±2.38)%、(6.31±1.08)%。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞凋亡率增加(P<0.05)。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞凋亡率降低(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細胞凋亡的促進作用。見圖3。

圖3 miR-135a調控PTEN對Caski細胞凋亡的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.6miR-135a調控PTEN對宮頸癌細胞轉移能力的影響 Transwell實驗檢測結果顯示，NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞穿膜數分別為(89.67±4.22)個、(40.33±3.84)個、(63.33±2.88)個。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞轉移能力降低(P<0.05)。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞轉移能力增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細胞轉移能力的抑制作用。見圖4。

圖4 miR-135a調控PTEN對Caski細胞轉移能力的影響(吉姆薩染色×200)PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.7miR-135a調控PTEN對Akt/mTOR的影響 Western blot實驗檢測結果顯示，與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞中pAkt和pmTOR蛋白表達降低，而與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細胞中pAkt和pmTOR蛋白表達增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對Akt/mTOR信號通路的抑制作用。見圖5，表3。

圖5 miR-135a負靶向調控PTEN對Akt/mTOR的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

表3 3組宮頸癌細胞中pAkt和pmTOR蛋白的相對表達量

3 討論

宮頸癌已成為全世界女性中第四大最常見的腫瘤，占全世界與腫瘤相關死亡的很大比例[1]。由于不同地區生活質量和醫療資源分配不均的差異，75%的宮頸癌患者發生在資源匱乏的發展中國家，由于早期診斷準確率低，患者確診時已處于晚期[9]。而研究報道國際婦產科聯合會(FIGO)分期Ⅰ期患者的存活率為80%～98%，但當患者出現轉移時，其存活率降低至50%，復發和轉移仍然是患者死亡的主要原因，所以宮頸癌仍然是發展中國家婦女與腫瘤相關死亡的最主要原因[3]。同時HPV感染和性行為的改變導致宮頸癌的發病率居高不下[7]。盡管宮頸癌治療在化療、放療和外科治療方面已取得了很大的進步，以及分子靶向治療、免疫治療和生物治療等新型治療方式的發展與應用，但是宮頸癌患者的預后仍然很差[10]。目前宮頸癌的發病機制尚未完全明確，因此在分子水平研究宮頸癌發病機制對其治療具有重要意義。

miRNA是一組內源性的小分子非編碼RNA，在細胞增殖、凋亡和分化等多種生物學過程中發揮重要作用。已經證實，miRNA在腫瘤組織中的表達與在良性和正常組織中的表達模式不同，miRNA在腫瘤組織中高表達或者低表達，異常表達的miRNA可作為腫瘤檢測或預后評估的分子標志物[11]。越來越多的研究報道，異常表達的miRNA在人類惡性腫瘤中除了作為各類分子標志物，在腫瘤的發生發展中也充當重要角色[12]。在宮頸癌中異常表達的miRNA也逐漸被發現，Leung等[8]比較了激光捕獲顯微切割的宮頸標本中miR-135a的表達水平，發現與癌前病變相比，宮頸癌中miR-135a的表達上調，且過表達miR-135a后，永生化宮頸上皮細胞系NC104-E6/E7的增殖和侵襲能力增加。miR-135a在食管癌、鼻咽癌和非小細胞肺癌等多種細胞中被報道為腫瘤抑癌miRNA[13-15]，而在子宮內膜癌中miR-135a促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移，并降低順鉑敏感性[16]。由此可見，miR-135a可發揮抑癌作用和促癌作用。但Chen等[17]報道，miR-135a在子宮內膜癌細胞系中低表達，miR-135a的過表達顯著抑制細胞增殖和遷移能力，其作用靶點是ASPH基因。Wang等[16]報道，miR-135a通過靶向AKT信號通路發揮促子宮內膜癌的作用，因此靶基因是miRNA發揮作用的關鍵。Leung等[8]研究發現，miR-135a通過靶向SIAH1基因參與宮頸癌的進展。我們通過研究miR-135a新靶基因分析miR-135a在宮頸癌中新的生物學功能及作用機制。

本研究采用qRT-PCR檢測miR-135a在宮頸癌細胞系中的表達水平，結果顯示與永生化宮頸上皮細胞H8相比，miR-135a在宮頸癌細胞系中表達增加，并選擇miR-135a高表達的宮頸癌細胞Caski進行生物學功能研究，抑制miR-135a的表達后，宮頸癌細胞的增殖和轉移能力降低，與Leung等[8]的研究一致。在子宮內膜癌中miR-135a高表達通過抑制腫瘤細胞的凋亡降低細胞對化療藥物的敏感性[16]，因此本文檢測miR-135a對宮頸癌細胞凋亡的影響，結果發現抑制miR-135a的表達，宮頸癌細胞的凋亡增加，表明miR-135a密切參與宮頸癌細胞增殖、轉移和凋亡。為了研究miR-135a的靶基因，本研究采用Targetscan7.1預測軟件發現PTEN基因的3'-UTR與miR-135a有結合位點。PTEN是經典的抑癌基因，在宮頸癌細胞中表達下調，與宮頸癌的臨床病理參數和預后不良相關[18]。同時PTEN低表達促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移，抑制細胞的凋亡[19]。本研究采用雙熒光素酶報道基因試驗檢測發現在宮頸癌細胞中miR-135a靶向調控PTEN基因，并且采用qRT-PCR檢測發現PTEN在宮頸癌細胞系中表達下降，與已有的研究一致[20]。在抑制miR-135a表達的宮頸癌細胞系中轉染PTEN siRNA后，生物學功能實驗發現，PTEN siRNA可以部分恢復抑制miR-135a表達的宮頸癌細胞的增殖和轉移能力，減少了細胞凋亡。表明miR-135a通過靶向PTEN在宮頸癌中發揮促癌作用。在子宮內膜癌中miR-135a可調控AKT信號通路發揮促癌作用[16]，研究報道Akt/mTOR信號通路在宮頸癌中激活后促進宮頸癌細胞的惡性表型，并可以作為腫瘤治療的靶點[20]。本研究結果顯示，miR-135a inhibitor抑制細胞中pAkt和pmTOR蛋白的表達，干擾PTEN的表達減弱了miR-135a inhibitor對宮頸癌細胞中pAkt和pmTOR蛋白表達的抑制作用。表明miR-135a在宮頸癌中靶向PTEN調控Akt/mTOR信號通路。

綜上所述，miR-135a靶向抑制PTEN促進宮頸癌細胞增殖和轉移能力，抑制細胞凋亡，可能通過調控Akt/mTOR信號通路發揮作用。miR-135a可能是治療宮頸癌的潛在靶點。