清腎顆粒對慢性腎衰竭大鼠腎組織細胞自噬及凋亡的影響和機制研究

趙 曄，王秀穎，于 磊

隨著各種慢性腎臟疾病的進展，最終會出現慢性腎衰竭(chronic renal failure， CRF)，但是目前尚無有效治療方法，腎移植雖然可以治愈CRF，但是其治療難度大、費用高，難以廣泛應用[1]。有研究顯示，腎組織細胞過度凋亡是引起腎功能障礙的重要機制[2]。自噬是一種細胞自我溶解的過程，其可將損傷的細胞器或大分子蛋白分解為小分子片段，并被細胞重新利用，研究顯示促進自噬會抑制腎組織中的細胞凋亡并保護腎功能[3]。近年來，中藥在治療CRF方面有顯著的進展，清腎顆粒具有改善腎功能、抑制炎癥反應的作用[4]，但其作用機制尚不明確。本研究通過動物實驗，探究清腎顆粒通過調控凋亡和自噬對CRF的作用，為臨床更好的治療CRF提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物和儀器 SD大鼠(清潔級，雌性，200±20 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司)，腺嘌呤(Sigma公司，美國)，ELISA和TUNEL凋亡試劑盒(碧云天公司，中國)，抗體(Abcam公司，美國)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)，化學發光試劑盒(Amersham，美國)，顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2模型制備和干預方法 30只大鼠隨機分為對照組、CRF組和CRF+清腎顆粒組，每組10只。CRF組和CRF+清腎顆粒組應用腺嘌呤構建CRF模型，其具體方法是在普通飼料中摻有5%的腺嘌呤，自由進食，共進行3周。CRF+清腎顆粒組給予清腎顆粒灌胃治療，將清腎顆粒溶于生理鹽水，根據臨床用量[4]和《實驗藥理學》[5]換算大鼠的清腎顆粒用藥量，劑量為20 mg/kg，每日1次，連續3周，對照組、CRF組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3觀察指標和檢測方法

1.3.1ELISA檢測腎功能指標：大鼠剪尾取血，離心(2000 r/min，20 min)后取上層血清，根據試劑盒的說明加入抗體和顯色劑，利用酶標儀檢測450 nm下的吸光度，通過標準曲線計算血清中尿素(BUN)、肌酐(Scr)的濃度。

1.3.2HE染色檢測腎組織損傷：大鼠通過腹腔注射過量2%戊巴比妥麻醉、斷頭處死，取出腎組織，用4%多聚甲醛固定并用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成4 μm的組織玻片標本。用蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%伊紅水溶液室溫下染色3 min。顯微鏡下觀察HE染色結果。

1.3.3TUNEL染色檢測細胞凋亡情況：將“1.3.2”中的切片根據試劑盒說明書進行操作，將其放置于TUNEL溶液中，在37℃下孵育1 h，之后依次進行顯色、DAPI染色細胞核，然后進行封片。凋亡率=凋亡陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3.4Western blot檢測自噬蛋白以及核因子-κB(NF-κB)通路：用組織勻漿機將腎組織均勻研磨萃取總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測量。每組取總量為40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(PAGE，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-Beclin1、anti-LC3、anti-NF-κB和anti-IκBα添加到膜中，并在4℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h。然后加入化學發光試劑進行顯影。GAPDH用作內參，用Image J測量灰度值計算蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1腎功能指標 CRF組BUN和Scr水平高于對照組，CRF+清腎顆粒組BUN和Scr水平顯著低于CRF組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠血清BUN、Scr水平比較

2.2腎組織損傷情況 對照組大鼠腎組織中細胞結構、形態、排列正常，染色均勻，腎小球和腎小管結構清晰可見。CRF組中細胞染色不均勻，細胞形態發生改變，腎小球和腎小管結構喪失，細胞出現大量凋亡。CRF+清腎顆粒組可見腎小球結構，但是結構數量較少，且也有細胞凋亡情況出現。見圖1。

圖1 3組大鼠腎組織損傷情況(HE×100)CRF為慢性腎衰竭

2.3腎組織中細胞凋亡水平 藍色為細胞核染色，紅色為凋亡細胞。見圖2。對照組、CRF組和CRF+清腎顆粒組腎組織中細胞凋亡率分別為(7.12±1.43)%、(28.35±3.89)%、(15.46±2.61)%。CRF組腎組織中細胞凋亡率高于對照組，CRF+清腎顆粒組低于CRF組(P<0.05)。

圖2 3組大鼠腎組織中細胞凋亡情況(TUNEL×400)CRF為慢性腎衰竭

2.4自噬水平比較 CRF組自噬標志蛋白Beclin1和LC3水平低于對照組，CRF+清腎顆粒組Beclin1和LC3水平高于CRF組(P<0.01)。見圖3和表2。

圖3 3組大鼠腎組織細胞Beclin1和LC3表達情況CRF為慢性腎衰竭，Beclin1和LC3為自噬標志蛋白

表2 3組大鼠腎組織細胞自噬標志蛋白Beclin1和LC3水平比較

2.5NF-κB和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白水平 CRF組NF-κB和IκBα蛋白水平高于對照組，CRF+清腎顆粒組NF-κB和IκBα蛋白水平低于CRF組(P<0.05，P<0.01)。見圖4和表3。

表3 3組大鼠腎組織中NF-κB和IκBα蛋白水平比較

圖4 3組大鼠腎組織中NF-κB和IκBα蛋白表達情況CRF為慢性腎衰竭，NF-κB為核因子-κB，IκBα為NF-κB抑制因子α

3 討論

CRF是一種以腎功能進行性和不可逆性惡化為特征的綜合征。CRF主要由高血壓、腎小球腎炎和糖尿病引起[6]。與其他慢性疾病患者相比，CRF患者往往需要更長時間、更頻繁的住院治療。腎衰竭會嚴重影響患者的生命健康和生活質量，是日益嚴重的公共衛生問題。

在中醫中，CRF的特點是濕熱、瘀血，清腎顆粒的主要成分包括白花蛇舌草、丹參、茵陳等，具有清熱化濕祛瘀的功效。近年來臨床上大量的研究已經證實了清腎顆粒在CRF中的作用，有研究顯示清腎顆粒可以改善氧化應激，從而改善CRF患者的腎功能[7]。王億平等[8]研究發現，清腎顆粒可以抑制CRF患者炎性細胞因子的水平，但是關于清腎顆粒治療CRF的機制尚不清楚。腎組織中的細胞不受控制的凋亡和纖維化是導致CRF的重要機制。自噬是細胞應對外界壓力的一種適應性反應，研究顯示誘導自噬可以抑制凋亡。本研究結果顯示，CRF組BUN、Scr、腎組織細胞凋亡率高于對照組，自噬標志蛋白Beclin1和LC3水平低于對照組；CRF+清腎顆粒組BUN、Scr水平、腎組織細胞凋亡率低于CRF組，Beclin1和LC3水平高于CRF組。提示CRF模型大鼠腎組織細胞的凋亡水平升高而自噬水平降低，給予清腎顆粒灌胃干預后，腎組織損傷顯著緩解，腎功能指標改善。研究顯示，清腎顆粒的主要成分白花蛇舌草、丹參、茵陳均具有誘導自噬和抑制凋亡的作用[9-11]。提示清腎顆粒可能通過誘導自噬抑制凋亡改善CRF大鼠模型的腎功能。

為進一步分析清腎顆粒調控自噬和凋亡的機制，對腎組織中NF-κB通路的影響。研究已經證實NF-κB通路的激活會通過誘導凋亡和氧化應激引起CRF大鼠腎組織中細胞的凋亡，參與CRF進程[12]。此外，NF-κB通路也具有調控自噬的作用，從而抑制炎癥反應緩解脂多糖誘導的腎損傷[13]。本研究結果顯示，CRF組NF-κB和IκBα蛋白水平高于對照組，CRF+清腎顆粒組NF-κB和IκBα蛋白水平低于CRF組。有研究顯示清腎顆粒會抑制CRF患者血清中的NF-κB水平和氧化應激反應[14]。研究顯示以白花蛇舌草為主要成分的中藥方可以抑制糖尿病腎病患者血清中NF-κB水平[15]。丹參的主要活性成分丹參酮ⅡA也可以通過抑制NF-κB緩解氧化應激反應[16]。也有動物實驗研究結果顯示，以茵陳為主的中藥方劑可以抑制NF-κB通路調控自噬和炎癥反應[17]。提示清腎顆粒可以通過抑制NF-κB通路誘導自噬抑制凋亡。

綜上所述，清腎顆粒可以通過抑制NF-κB通路誘導腎組織細胞的自噬，從而抑制凋亡，緩解CRF大鼠模型的腎功能。關于清腎顆粒調節NF-κB通路和自噬的機制仍需要進一步研究。