加載miRNA-21殼聚糖基納米粒對牙周膜干細胞成骨分化的影響

吳廣升，王亞男，惠光艷，梅 濤，王忠山

miRNA是一種由21～25個核苷酸組成的較小的內(nèi)源性非編碼RNA，可以通過提高或抑制目的mRNAs的降解而調(diào)控增殖、分化、凋亡及癌變等一系列的細胞活動[1-2]。miRNA在干細胞成骨分化過程中發(fā)揮了非常重要的作用，已經(jīng)被廣泛應用于骨再生方面的研究，多種miRNA具有促進干細胞成骨分化的作用[3-4]。但由于游離miRNA存在極易降解性、細胞難以攝取，潛在的免疫源性等缺陷，必須采用合適的載體才能提高miRNA轉(zhuǎn)染效率。殼聚糖(CS)是一種純天然高分子多糖，自身帶正電荷，可以作為RNA、DNA、生長因子及抗腫瘤藥物載體[5]。CS基納米粒作為一種非病毒載體，避免了外源基因序列的插入，但將其應用于miRNA轉(zhuǎn)染體系仍存在轉(zhuǎn)染效率不高的問題[6]?；蚍聪蜣D(zhuǎn)染技術(shù)是先將DNA(或RNA)通過基質(zhì)錨定在一定界面上，再將細胞接種于該基質(zhì)表面，細胞貼壁的同時攝取錨定在介質(zhì)表面DNA(或RNA)而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。與常規(guī)轉(zhuǎn)染方法相比，該轉(zhuǎn)染體系可更有效地接觸細胞表面從而達到更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性等效果[7-8]。miR-21是一種具有促進成骨分化作用的miRNA，可上調(diào)成骨相關基因表達，在體內(nèi)可促進骨組織再生[9]。本實驗制備殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸/miR-21納米粒(CTH/miR-21 NPs)并對牙周膜干細胞(PDLSCs)進行反向轉(zhuǎn)染，觀察其轉(zhuǎn)染效率及促進成骨基因表達作用，為CTH/miR-21 NPs進一步應用于促進牙周組織再生提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1主要材料與設備 CS(醫(yī)用級，脫乙酰度≥90%，分子量約100 kDa，金殼藥業(yè)，浙江)，透明質(zhì)酸(HA,分子量約10 kDa，福瑞達醫(yī)藥，山東)，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、雙抗(Hyclone,美國)；L-谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶(COLⅠ)和Dispase酶(Sigma，美國),0.25%胰蛋白酶(雷根，北京)；乙酸(優(yōu)級純，國藥集團)，CO2恒溫細胞孵箱(Thermo Forma，美國),miR-21(吉瑪制藥，上海)；超凈工作臺(博科生物，山東)；熒光顯微鏡(Olympus，BX51，日本),倒置相差顯微鏡(Olympus，日本),掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800，日本)；離心機、反轉(zhuǎn)錄PCR儀(Eppendorf，德國),實時熒光定量分析儀(Bio-rad，美國),納米粒徑測量儀(Zetasizer NanoZS90, Malvern Instrument，英國)。

1.2CTH/miR-21 NPs的制備及鑒定 參考相關文獻[6]制備方法，采用離子交聯(lián)的方法制備CTH/miRNA-21 NPs。將適量CS溶于0.1 mol/L的乙酸溶液中，制備1 mg/ml的CS乙酸溶液。再將適量三聚磷酸鈉(TPP)和HA分別溶于去離子水，獲得1 mg/ml的TPP和HA溶液。將CS、TPP和HA按體積比1∶0.1∶0.025，1∶0.15∶0.025，1∶0.15∶0.05，1∶0.15∶0.1，1∶0.15∶0.15及1∶0.15∶0.5的比例進行混合。置于磁力攪拌器上以3000 r/min的速度攪拌10 min，形成乳光色的CTH NPs懸液。將適量濃度為20 μmol/ml的miR-21加入CTH NPs中(N∶P=20∶1，即氮/磷，指CS中正電荷的氨基與miR-21中負電荷的磷酸基的摩爾比為20∶1)，并用移液器抽吸混勻，振蕩器上震蕩10 s后室溫下靜置60 min，獲得CTH/miR-21 NPs。采用激光粒度儀檢測CTH/miR-21 NPs粒徑和電位。

1.3CTH/miR-21 NPs反向轉(zhuǎn)染體系的制備及鑒定 將適量的CTH/miR-21 NPs(含300 pmol miR-21)混入100 μl的0.2%明膠溶液中，震蕩混勻后滴加入6孔板中，涂覆均勻，超凈工作臺內(nèi)風干后戊二醛固定，噴金，掃描電鏡觀察。

1.4PDLSCs的原代培養(yǎng)及鑒定 收集4例18～22周歲(已簽署知情同意書)因正畸治療需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙。超凈工作臺內(nèi)用11號手術(shù)刀片刮取牙根中1/3處的牙周膜組織，并剪成體積0.5～1 mm3的組織碎片，移入15 ml離心管并滴加5 ml含有1% Dispase和1% COLⅠ的混合消化液，37℃環(huán)境下消化45 min，其間每隔15 min輕輕震蕩數(shù)次，重懸后接種于6孔板中(含10% FBS，1%雙抗)，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，細胞匯合至80%后胰酶消化法傳代。采用有限稀釋克隆法獲取3～5代PDLSCs用于后續(xù)實驗。采用流式細胞分析儀對細胞表面標記分子進行檢測。采用胰酶消化法收集第3代PDLSCs，PBS洗3遍，PBS重懸、計數(shù)，與CD31、CD34、CD45、CD29、CD90以及CD105室溫避光孵育40 min后，將PDLSCs轉(zhuǎn)移至流式管中，采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達水平。成骨誘導:選取第3代PDLSCs，當細胞融合約90%時，用成骨誘導液繼續(xù)培養(yǎng)21 d，4%多聚甲醛固定后茜素紅染色。成脂誘導:選取第3代PDLSCs，當細胞融合約90%時，用成脂誘導液繼續(xù)培養(yǎng)2周，4%多聚甲醛固定后油紅O染色。

1.5PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs的情況 將CTH/miR-21 NPs(已用FITC標記CS， Cy-3標記miR-21)以300 pmol/孔的量加入6孔板，并加入適量的0.2%明膠溶液交聯(lián)，干燥。PDLSCs以2×105/孔的濃度接種到6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h。吸出原培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，每孔加500 μl DAPI，PBS沖洗3遍，去除多余的DAPI。熒光顯微鏡下觀察PDLSCs中DAPI(藍色熒光)、FITC(綠色熒光)及Cy-3(紅色熒光)的分布，拍照。

1.6CTH/miR-21 NPs轉(zhuǎn)染PDLSCs效率鑒定 采用流式細胞儀觀察CTH/miR-21 NPs轉(zhuǎn)染PDLSCs的效率。按照上述方法將CTH/miR-21 NPs(Cy-3標記)以0、150、300、450 pmol/孔的量反向轉(zhuǎn)染PDLSCs 24 h，PBS輕輕洗滌2次、重懸，4%多聚甲醛固定。濃度為0 pmol/孔組為陰性對照，根據(jù)PDLSCs發(fā)射出來的紅色熒光的比率測定轉(zhuǎn)染效率。每個樣本重復檢測3次。

1.7CTH/miR-21 NPs轉(zhuǎn)染PDLSCs后成骨相關基因的表達 采用RT-PCR方法檢測CTH/miR-2 NPs轉(zhuǎn)染PDLSCs后成骨基因表達水平。將CTH/miR-21 NPs以0、150、300、450 pmol/孔的量加入6孔板中，并用0.2%明膠溶液交聯(lián)。PDLSCs以2×105/孔的濃度接種到6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)3 d。吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，以用500 μl/孔的量加入TRIzol裂解細胞，收集細胞內(nèi)的總RNA。采用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。成骨相關基因RUNT相關轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨橋素(OPN)、骨鈣素(OCN)、COLⅠ的表達水平用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行檢測。實驗中使用的上游和下游引物序列見表1。數(shù)據(jù)分析采用iQTM5光學系統(tǒng)軟件2.0。數(shù)據(jù)中所有目的基因表達水平均通過管家基因GAPDH進行校正。

表1 成骨相關基因引物序列

2 結(jié)果

2.1CTH/miR-21 NPs粒徑及電位檢測結(jié)果 CTH/miR-21 NPs的粒徑和Zeta電位由CS、TPP和HA三者之間的體積比所決定。隨著HA比率的增高，CTH/miR-21 NPs的粒徑由147.3 nm增加至288.5 nm，而Zeta電位由44.5 mV逐漸降低至21.7 mV。當CS∶TPP∶HA為1∶0.15∶0.025時，CTH/miR-21 NPs的粒徑最小。見圖1。

圖1 CTH/miR-21 NPs的粒徑及Zeta電位CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸/miR-21納米粒，CS為殼聚糖,TPP為三聚磷酸鈉，HA為透明質(zhì)酸

2.2CTH/miR-21 NPs反向轉(zhuǎn)染體系的形態(tài)學特征 CTH/miR-21 NPs呈球形均勻地分布在培養(yǎng)板表面，納米球的周緣被明膠部分包繞。見圖2。

圖2 交聯(lián)在培養(yǎng)板上的CTH/miR-21 NPs形態(tài)特征CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸/miR-21納米粒

2.3PDLSCs特性鑒定 PDLSCs陰性表達造血干細胞表面標記物：CD31、CD34、CD45；陽性高表達間充質(zhì)干細胞表面標記物：CD29、CD90、CD105，證明本實驗原代培養(yǎng)的細胞具有間充質(zhì)來源的干細胞特征。見圖3。本研究所培養(yǎng)人PDLSCs呈典型長梭形，經(jīng)體外成骨誘導21 d后，茜素紅染色陽性，密集排列的細胞表面形成不規(guī)則紅色礦化結(jié)節(jié)；PDLSCs經(jīng)成脂誘導14 d后，油紅O染色陽性，PDLSCs細胞內(nèi)及細胞間散在分布大小不等的圓形紅色脂滴，證實PDLSCs具有多向分化潛能。見圖4。

圖3 PDLSCs表面標記物表達情況PDLSCs為牙周膜干細胞；A.陰性表達造血干細胞表面標記物；B.陽性高表達間充質(zhì)干細胞表面標記物

圖4 PDLSCs培養(yǎng)及鑒定PDLSCs為牙周膜干細胞；A.第3代PDLSCs；B.礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色；C.油紅O染色

2.4PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs情況 熒光顯微鏡下，PDLSCs的細胞核被DAPI染成藍色(圖5A)，CTH/miR-21 NPs中被FITC標記的CS呈綠色(圖5B)，Cy-3標記miR-21呈紅色(圖5C)，圖5D為圖5B和圖5C融合之后，綠色和紅色完成重合，證實miR-21與CTH NPs完整地結(jié)合在一起并被細胞攝入。圖5E為圖5A、5B、5C融合，藍色的細胞核周圍綠色及紅色熒光聚集，說明PDLSCs可以吞噬大量的CTH/miR-21 NPs。流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，300和450 pmol/孔可以達到90%以上的轉(zhuǎn)染效率，高于0、150 pmol/孔(P<0.01)。見圖5F。

圖5 PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs情況及CTH/miR-21 NPs轉(zhuǎn)染效率A.DAPI標記細胞核(藍色)；B.FITC標記CS(綠色)；C.Cy-3標記miR-21(紅色)；D.為圖B和圖C融合；E.為圖A、B、C融合；F.不同濃度CTH/miR-21 NPs轉(zhuǎn)染效率；PDLSCs為牙周膜干細胞，CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸/miR-21納米粒；與0 pmol/孔比較，bP<0.01；與150 pmol/孔比較，dP<0.01

2.5反向轉(zhuǎn)染后PDLSCs成骨相關基因表達水平 與0 pmol/孔組比較，300、450 pmol/孔組RUNX2、OPN、OCN和COLⅠ水平及150 pmol/孔OPN和COLⅠ水平上調(diào)，且300、450 pmol/孔組OPN、OCN水平高于150 pmol/孔組(P<0.05，P<0.01)。見圖6。

圖6 不同濃度CTH/miR-21NPs對PDLSCs成骨相關基因表達情況PDLSCs為牙周膜干細胞，CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸/miR-21納米粒，RUNX2為RUNT相關轉(zhuǎn)錄因子2，OPN為骨橋素，OCN為骨鈣素,COLⅠ為Ⅰ型膠原酶；與0 pmol/孔組比較，aP<0.05，bP<0.01；與150 pmol/孔組比較，cP<0.05

3 討論

牙周炎是導致成人牙齒松動和脫落的主要原因之一，如何使缺損的牙周組織再生是一個具有重大挑戰(zhàn)性的臨床問題。隨著組織工程技術(shù)和生物材料學的不斷發(fā)展進步，牙周組織再生研究進入了高速發(fā)展的新階段。PDLSCs是存在于牙周韌帶組織中的間充質(zhì)干細胞(MSCs)，具有很強的自我更新能力以及多向分化潛能，可以分化為牙骨質(zhì)和牙周膜。PDLSCs被公認為目前牙周組織工程中最佳的種子細胞[10]。但PDLSCs需要在特定的微環(huán)境誘導下才能持續(xù)進行成骨分化。

近年來，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物醫(yī)學領域得到越來越廣泛應用。傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染方法是陽離子聚合物或脂質(zhì)體等通過靜電作用結(jié)合RNA或DNA形成納米復合體，隨后加入細胞培養(yǎng)基中，依靠重力作用沉降至已經(jīng)貼壁細胞的表面，再通過胞吞作用進入細胞，這種基因轉(zhuǎn)染方法被稱為正向轉(zhuǎn)染。然而，其缺陷在于復合物粒徑不穩(wěn)定，并且為了獲得較高轉(zhuǎn)染效率需要提高復合體濃度而引起一定的細胞毒性。反向轉(zhuǎn)染具有以下優(yōu)勢：①載體/基因復合體更加穩(wěn)定，并還可以在固定位置釋放基因；②與細胞膜直接接觸，便于細胞內(nèi)吞，提高轉(zhuǎn)染效率；③轉(zhuǎn)染過程可以在血清環(huán)境中實現(xiàn)[7-8]。

miRNA可以調(diào)控多種干細胞成骨分化，為了克服游離的miRNA存在的極易降解性、細胞難以攝取和潛在的免疫源性等不足，采用合適的載體負載miRNA后再進行轉(zhuǎn)染是最普遍的方法。Wu等[11]將脂質(zhì)體/miRNA復合物通過凍干的方式結(jié)合培養(yǎng)板表面，隨后將骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)接種于該培養(yǎng)板表面進行反向轉(zhuǎn)染，獲得了更高的轉(zhuǎn)染效率及更低的細胞毒性，并且凍干后的脂質(zhì)體/miRNA復合物在4℃或-20℃條件下保存90 d后仍然可以反向轉(zhuǎn)染MSCs，且轉(zhuǎn)染效率沒有太大變化。Wu等[12]又通過將脂質(zhì)體/miRNA凍干在經(jīng)過微弧氧化形成的微孔氧化鈦表面，制備miRNA功能化的微孔鈦種植體。微孔氧化鈦表面為miRNA負載提供了更大的表面積，使miRNA能夠在孔隙內(nèi)保留，直到細胞轉(zhuǎn)染完成。將MSCs接種到miRNA功能化的微孔氧化鈦表面后，觀察到更高的miRNA轉(zhuǎn)染效率，且沒有明顯的細胞毒性。同時可以上調(diào)MSCs成骨相關基因的表達，促進堿性磷酸酶的產(chǎn)生、膠原分泌和細胞外基質(zhì)礦化等。

CS基納米粒作為一種非病毒載體，已經(jīng)被應用于miRNA正向轉(zhuǎn)染體系的研究中，但其轉(zhuǎn)染效率接近70%[13-15]。Wang等[16-17]以CS-HA為載體，制備了CS/HA-miRNA NPs反向轉(zhuǎn)染體系。先將CS/HA-miRNA NPs交聯(lián)在微孔氧化鈦表面，發(fā)現(xiàn)對人MSCs的轉(zhuǎn)染效率≥90%。將CS/HA-miRNA NPs交聯(lián)培養(yǎng)板上對骨髓MSCs細胞膜片的轉(zhuǎn)染效率進行觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率在80%以上，且均可以顯著提高MSCs的成骨相關基因的表達水平。

miRNA對多種干細胞的分化具有調(diào)控作用[4]，miR-21是一種具有很強的促進成骨分化作用的miRNA，可以上調(diào)成骨相關基因的表達[18]。Yang等[9]以慢病毒作為載體，構(gòu)建miRNA-21/LacZ轉(zhuǎn)染體系并轉(zhuǎn)染BMSCs，在體外顯著提高了骨形成蛋白-2(BMP-2)、RUNX2、OCN、OPN、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達水平；用miRNA-21/LacZ轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，再種植于β-磷酸三鈣支架材料內(nèi)，最后植入修復大鼠顱骨極限缺損處，取得了顯著的促進骨再生效果。

本研究選擇miR-21作為反向轉(zhuǎn)染PDLSCs的目的基因，實驗結(jié)果證實CTH/miR-21 NPs可以成功地轉(zhuǎn)染PDLSCs，并顯著提高相關成骨基因的表達水平，為反向基因轉(zhuǎn)染技術(shù)應用于牙周組織再生提供了新的思路。