江西3個地理群體野生鯽肌間骨的比較分析

李福貴 ，程林慧，韓雨晴，張士林，何 坤，孫藝文，吳華東，劉凱月，段曉迪，董傳舉*

（1.江西農業大學動物科學技術學院，江西南昌 330045；2.河南師范大學水產學院，河南新鄉 453007）

【研究意義】肌間骨（intramuscular bone，IB），又名肌間刺或肌間小骨，分布于椎骨兩側肌間隔中，是由肌膈結締組織中的間充質細胞不經過軟骨階段直接骨化而成的膜性硬骨，是硬骨魚類特有的結構之一[1-3]。根據其附著位置分為髓弓小骨（epineuria bone）、脈弓小骨（epipleural bone）和椎體小骨（epicentra?lia bone）3類[1]。肌間骨是魚肉肌肉品質的一個重要指標，不同魚類肌間骨的數量、性狀和分布特征差異顯著，在很大程度上影響其經濟價值。因此，選育肌間骨數量少、形態簡單的品種具有重要的生產意義與經濟價值。【前人研究進展】迄今對肌間骨的研究報道主要集中在幾個方面：不同魚類肌間骨解剖和形態學分析[4-5]，肌間骨發育與骨化模式分析[6-13]，肌間骨形成調控基因或microRNA 鑒定與功能驗證[14-21]，通過雜交、雌核發育等多種育種手段選育肌間骨少的魚類新品系等[22-26]。研究表明，年齡、游泳方式、進化地位、遺傳倍性等均對魚類肌間骨的數量、形態與分布有顯著的影響[1-2,5,22,26-27]。肌間骨的數量、形態與分布不僅可以作為魚類分類形態學指標，同時也是經濟魚類食用品質的重要性狀。【本研究切入點】鯽（Carassius auratus），隸屬于鯉科（Cyprinidae），鯽屬（Carassius），是我國常見的大宗淡水魚類之一，具有繁殖力強、抗病抗逆能力強、肉質鮮美等優點，深受消費者的歡迎[28-31]。隨著系列優良品種的推廣，2018 年全國鯽總產量達277 萬余噸[31]。然而，在常見的大宗淡水魚類品種中，鯽的肌間骨數量及類型數量最多[30]。目前有學者對洞庭水系二倍體鯽（C.auratus）[26]、異育銀鯽[4]及其選育品系（候選品種）[22]、淇河鯽（Carassius auratusvariety Qihe）[14]、彭澤鯽以及其他改良鯽鯉雜交品種（或品系）[26]的肌間骨的數量、形狀和分布進行了比較研究，但尚未有不同地理群體鯽肌間骨的比較分析報道。【擬解決的關鍵問題】因此，本研究對江西萍鄉（PX）、南昌（NC）、瑞昌（RC）3 個地理群體野生鯽肌間骨的數目、形態和分布進行了詳細的觀察和統計，以便為鯽肌間骨遺傳改良提供形態學基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018—2019年在江西農業大學動物科學技術學院水產系實驗室進行。3個野生鯽地理群體分別采自江西萍鄉萍水河（PX，113.79°E，27.57°N，海拔85 m）、南昌贛江（NC，116.07°E，28.80°N，海拔17 m）、瑞昌長河（RC，115.67°E，29.65°N，海拔97 m），地理位置分布見圖1。

圖1 樣品采集點信息Fig.1 Location information of sample collection

圖2 3個鯽地理群體外形Fig.2 External morphology of crucian carps from 3 geographical populations

為排除個體大小對鯽肌間骨數量的影響，分別采集了體質量相近的個體進行分析。采用傳統的方法進行試驗魚形態學測量，3個群體外形圖見圖2，樣品數和規格參數見表1。

表1 3個鯽地理群體形態學測量Tab.1 Morphological measurement of crucian carps from 3 geographical populations

1.2 肌間骨的解剖與形態觀察

肌間骨的解剖、形態觀察以及分布參照Long 等[32]、李志等[22]和黎玲等[26]描述的方法進行。將活魚麻醉后，擦干魚體表水分后測量全長、體長、頭長、體寬、體高、體質量、側線鱗數等指標。用紗布將魚包裹，于滅菌鍋0.05～0.10 MPa 壓力條件下蒸5 min 至九成熟。待魚體降溫后剝去紗布，于解剖盤中去除皮膚組織，小心剔除肌肉，從尾至頭依次取出髓弓小骨和脈弓小骨，按其在魚體中的位置整齊排列，用Canon EOS 70D相機拍照記錄。

1.3 數據統計分析

實驗數據采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，數據間比較用Duncan法進行。柱狀圖采用Sig?maplot12.0軟件繪制，取P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 3個地理群體野生鯽總肌間骨數目比較分析

本研究對PX、NC與RC 3個地理群體鯽肌間骨進行了解剖觀察，3個群體均有髓弓小骨和脈弓小骨，均無椎體小骨。對3個群體的左側、右側與總肌間骨數目進行了統計與比較，結果見表2。對3個群體的髓弓小骨與脈弓小骨數目進行了統計與比較，結果見表3。

表2 3個鯽地理群體肌間骨數目Tab.2 Intermuscular bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表2 結果表明：PX、NC 與RC 3 個群體總肌間骨數目分別為（80.00±3.08），（79.83±8.06）和（83.25±4.99），兩兩之間均無顯著性差異（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個群體右側肌間骨數目分別為（39.60±1.82）、（40.83±6.55）和（41.50±4.04），兩兩之間均無顯著性差異（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個群體左側肌間骨數目分別為（40.40±2.61）、（39.00±1.55）和（41.75±0.96），PX 與RC 間無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著大于NC群體（P＜0.05）。

表3 3個鯽地理群體髓弓小骨與脈弓小骨數目Tab.3 Epineural bone and epipleural bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表3 結果表明：PX、NC 與RC 3 個群體的髓弓小骨數分別為（54.80±2.39）、（54.80±6.85）和（54.00±3.37），兩兩之間差異均不顯著（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個群體的髓弓小骨數分別為（25.20±3.90）、（25.17±2.32）和（29.25±4.11），兩兩之間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 3個地理群體鯽肌間骨形態與數量統計分析

通過解剖觀察，3 個群體的肌間骨分為“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、樹枝形和兩端多叉形等8 種類型（圖3 和表4）。與已報道的其他鯉科魚類相比[4]，“）”是特有的肌間骨形態。PX、RC 群體均包含7 種類型，而NC 群體包含8 種類型，即多了“兩端多叉型”，且數量較多（圖3 和表4），呈現了更加復雜的肌間骨形態特征。

由表4 可知，3 個群體所含“I”與“）”形肌間骨數占比為40%左右，而由此分化的更加復雜的“卜”與“Y”形肌間骨數占比為50%左右，其他3種（4種）更加復雜的肌間骨數占比為10%左右。

圖3 3個地理群體鯽肌間骨的比較Fig.3 Comparison of 7（or 8）various types of intermuscular bones among crucian carps from 3 geographical populations

表4 3個地理群體鯽不同形態肌間骨數目Tab.4 Number of intermuscular bones in Crucian carps from 3 geographic populations

由圖4可知，“I”形、“卜”形、“Y”形、“一端多叉”形等4種類型肌間骨數在PX、NC與RC 3個群體中均沒有顯著性差異（P＞0.05）；NC 群體“）”形肌間骨極顯著少于PX 與RC 群體（P＜0.01），兩端兩分叉形肌間骨數量顯著高于RC（P＜0.05）、極顯著高于PX群體（P＜0.01），樹枝形肌間骨與PX無顯著差異且兩者均顯著低于RC群體（P＜0.05），兩端多分叉形肌間骨極顯著高于PX與RC群體（P＞0.01）。

圖4 3個地理群體鯽不同肌間骨的平均數目Fig.4 The average number of intermuscular bones in crucian carps from 3 geographical populations

2.3 3個地理群體鯽不同形態肌間骨分布差異分析

參照其他鯉科魚類肌間骨研究方法，筆者從尾部向頭部逐步解剖，并依次記錄肌間骨的形態、數量及分布位置。肌間骨分布從尾部往頭部方向1-9 體節劃定為尾部，從第10 體節至27 體節為軀干部，脊椎往背部方向為軸上部，脊椎往腹部方向為軸下部（圖5）。3 個地理群體鯽不同形態肌間骨分布差異性分析結果見表5。

圖5 3個地理群體鯽肌間骨的形態與分布Fig.5 Morphology and distribution of intermuscular bone in crucian carps from 3 geographical populations

表5 3個地理群體鯽不同形態肌間骨分布差異性分析Tab.5 Difference analysis of intermuscular bones distribution in crucian carps from 3 geographic populations

圖5 與表5 可知：PX、NC 與RC 3 個地理群體鯽左側、右側上的軀軸上肌間骨總數均大于軀軸下肌間骨數，尾軸上、下肌間骨數目差異不大；PX、NC 與RC 3 個群體左側、右側的軀軸上肌間骨數目均顯著大于尾軸上肌間骨數目（P＜0.05或P＜0.01），軀軸下肌間骨數均低于尾軸下肌間骨數目。不同形態肌間骨在PX、NC、RC 3個群體中分布特征比較顯示：“I”形在左右軀軸上、下部以及左右尾軸上的分布數量均無顯著差異（P＞0.05），但在PX 左尾軸下的分布數量顯著低于NC、RC（P＜0.05），在RC右尾軸下的分布數量顯著低于PX、NC；“）”形在NC軀軸與尾軸上、下部分布數量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“卜”形在NC 軀軸上下部與尾軸上下部分布數量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“Y”形在NC 軀軸上部分布數量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01），在NC 尾軸上、下部分布數量均顯著高于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；兩端兩分叉形在NC 軀軸上部分布數量顯著高于PX、RC（P＜0.05或P＜0.01）；樹枝形在PX左尾下部分布數量顯著低于NC、RC（P＜0.05）；兩端兩多叉形僅在NC群體中有分布，左右側分布數量無顯著差異，在尾軸上、下部分布數量上無顯著差異，但都顯著低于軀軸上、下的分布數量。NC軀軸下幾乎無肌間骨分布，而PX、RC兩個群體軀軸下均有“）”形、“卜”形肌間骨。上述結果表明，PX、RC群體軀干部分肌間骨分布數量均高于NC，而尾部肌間骨分布數量均低于NC。

3 討論

絕大部分鯉科魚類具有較復雜的肌間骨且肌肉疏松[4]。因此，有學者認為肌間骨的主要作用可能是肌節間的力量傳導[32-34]，即在肌肉收縮時限制肌節的變形[35-36]。然而，蛋白質含量較高的魚類，如鮭形目或鱸形目魚類，肌肉中很少或沒有肌間骨[1-2,5]，因為其可依靠肌纖維進行肌肉力量傳導，較少或不需要借助肌間骨進行力量傳遞[1]。李志等[22]推測魚類肌肉中蛋白質含量與肌間骨的數量相關，但目前仍缺乏直接的實驗證據。鑒于肌間骨對鮮魚食用及深加工的不利影響，掌握魚類肌間骨分布特征，并在此基礎上通過有效的育種方法進行遺傳改良，最終獲得更少或沒有肌間骨的品種，進而可為人類提供更高品質肉類產品。

本文發現PX、NC與RC 3個群體野生鯽肌間骨分布特征均與已報道[4]的鯉科魚類相似，表明3個群體肌間骨分布與進化時空與其他鯉科魚類處于相近階段。總肌間骨數目、右側肌間骨數目在PX、NC與RC 3個群體中兩兩之間均無顯著性差異（P＞0.05），左側肌間骨數目PX與RC群體間無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著大于NC群體（P＜0.05），表明部分鯽的肌間骨并非呈左右對稱分布且不同群體之間會發生變化，這種現象在其它鯉科魚類中同樣存在[4-5,9,37]，但與國內早期學者的研究不一致[38]，導致此現象的原因尚無明確的定論，但研究報道表明不同魚類的體型、生態習性、游泳速度等均對其肌間骨數量有重要影響[9,27,39]。

通過肌間骨形態分析發現，3個群體的肌間骨共有“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、樹枝形和兩端多叉形8 種類型。與已報道的其他鯉科魚類相比[4]，“）”是特有的肌間骨形態，與聶春紅等[25]報道的團頭魴特有的“（”肌間骨一致。PX、RC 群體均包含7 種類型，而NC 群體包含8 種類型，即多了“兩端多叉型”，且數量較多（圖3 和表4），表明NC 群體的肌間骨形態特征更加復雜。圖3 和表4結果表明，PX、RC群體軀干部分肌間骨分布數量均高于NC，而尾部肌間骨分布數量均低于NC。考慮3個群體所處河流的水流速度對肌間骨數量的影響，本研究中PX 取樣地萍水河是湘江第一支流，流域面積達584.7 km2，徑流量年均值18.3 m3/s，平均流速約為0.25 m/s（2016 年政府環評報告）；NC 取樣地贛江南昌段流域面積達83 500 km2，年徑流量約2 130 m3/s，年均流速約為3.3 m/s；RC 取樣地為江西賽湖上游段，平均水深2 m，汛期時可達10 m，水域相對封閉，流速可以忽略不計。因此，推測棲息地水流速大是導致NC 群體尾部肌間骨數量更多且更復雜的原因。此結果進一步驗證了Danos 和Staab[33]提出的機械力推動了真骨魚類骨骼變異和進化的觀點。

本研究觀察到了3個群體鯽肌間骨數量及分布特征差異，但原因尚不明確。目前對于肌間骨形成的主要調控基因和作用機制的研究，具有一定進展，例如：Lü 等[40]研究發現MsxC（muscle segment homeobox C）基因可能對唇?肌間骨的形成有一定影響；Wan 等[20]研究表明團頭魴miRNA 可能對低等真骨魚類肌間骨形成具有調控作用；張偉卓[16]研究表明團頭魴BMP 家族基因在其肌間骨發生發育中起到表達調控作用；陳宇龍等[17]研究表明團頭魴tnmd/xirp2a是其肌腱發育的重要相關基因；何蘋萍等[18]發掘了與禾花鯉與建鯉肌間骨miRNAs；田雪等[14]、王良炎等[15]、楊敏璇等[30]研究揭示了SOST基因在淇河鯽/鯽肌間骨骨化過程中起到重要調控作用。盡管越來越多報道顯示相關基因或miRNA的對肌間骨形成有重要的調控作用，但仍無法解析不同地理群體間肌間骨的差異形成原因。因此，筆者推測魚類肌間骨的形成可能是由多基因或相關調控因子形成的復雜調控網絡決定，同時環境因子（如水流速度）誘發的表觀遺傳變異共同構成了更加多樣的差異。具體作用機制，仍需進一步研究。

鯽魚味道鮮美、營養豐富，但肌間骨較多，鮮肉食用和深加工利用率差，因此迫切需要通過技術手段減少其肌間骨數目。目前，研究人員通過人工誘導雌核發育獲得了一尾無肌間骨的草魚突變體，且其體型、生長、脊椎骨和附肢骨發育均正常[41]；黎玲等[26]通過遠緣雜交并結合人工雌核發育，并經多代選育獲得的改良二倍體紅鯽，以及改良四倍體鯽鯉與改良二倍體紅鯽倍間雜交獲得的改良三倍體鯽鯉“湘云鯽2 號”的總肌間骨數目均少于野生二倍體鯽和彭澤鯽；蔣文枰等[23]通過遠緣雜交獲得的鲌魴F1和F2肌間骨數目減少，均表現出比母本翹嘴鲌有利于食用與深加工的優勢，鲌魴F2的總肌間骨數目略低于鲌魴F1，但每一肌節平均肌間骨數目顯著低于鲌魴F1；李志等[22]利用團頭魴精子與銀鯽E 系卵子受精后輔以冷休克處理，獲得后代經多代雌核雌核發育得到異育銀鯽F 系，其6 月齡和18 月齡銀鯽F 系軀個體體軸上肌節間的復雜“Y”形髓弓小骨數目均比相應月齡的銀鯽A+系少，而簡單的“I”形髓弓小骨數目比相應月齡的A+系多，表現出一種有利于食用的優勢。這些結果表明，通過遠緣雜交可以獲得肌間骨較少的優良品種。因此，鑒于不同地理群體鯽間肌間骨數量及形態特征存在差異，通過采集親緣關系較遠的鯽地理群體為親本，結合人工雌核發育與雜交，可能有助于獲得肌間骨較少的鯽新品種。