微囊藻毒素-LR對鯉魚上皮瘤細胞活力及顯微、超微結構的影響

劉 林，何 麗，林長高，周 穎，隗黎麗

（江西農業大學動物科學技術學院，江西南昌 330045）

【研究意義】近年來，淡水水體富營養化現象日益嚴重，由此導致的藍藻水華污染問題已受到國內外學者的廣泛關注。一些常見的藍藻類如銅綠微囊藻和魚腥藻等可在其細胞內部合成產生多種微囊藻毒素（microcystins，MCs）[1]，其中微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR）是MCs異構體中最為常見且毒性最強的一種毒素[2]。已有研究表明MC-LR 可通過口、鰓或皮膚進入魚體內，干擾魚類的正常生長發育，危害魚類種群安全。同時，MC-LR 進入魚體后還能通過食物鏈的生物富集對人類健康造成威脅[3]。魚類體表是抵御MC-LR 進入魚體的第一道防線，但且其體表上皮細胞無法形成角質化，比哺乳動物體表上皮細胞更為脆弱[4]。因此，了解MC-LR 對魚類體表上皮細胞所造成的影響具有十分重要的生態學意義。【前人研究進展】MC-LR 可通過特定的轉運系統，即有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）主動轉運進入魚體內[5]，并蓄積在肝臟、腎臟和性腺等組織器官中，從而產生多種毒性作用[6]。如Jiang 等[7]研究表明，MC-LR 可通過促進鯉魚肝臟中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，誘導魚體肝細胞氧化應激和細胞凋亡，最終導致肝臟損傷。而Huang等[8]則指出，MC-LR暴露可對草魚腎細胞中細胞骨架相關基因的表達產生影響，導致細胞骨架發生解體或重排。除此之外，MC-LR還可通過誘導細胞自噬、線粒體損傷、細胞膜完整性喪失或脂質過氧化等機制發揮毒性作用[9-10]。【本研究切入點】有學者[11]發現：MC-LR可通過細胞膜擴散進入人表皮細胞中，并對細胞增殖、細胞骨架及細胞器結構產生不利影響。亦有研究[12]指出當動物體表受損時，MC-LR可更快的通過表皮滲透進入細胞中。這些研究提示MC-LR 接觸動物體表后產生的影響值得重視，但MC-LR 在魚類體表中的研究卻較為匱乏。【擬解決的關鍵問題】本研究以鯉魚EPC 細胞作為魚類體表上皮細胞模型，采用MTT 法檢測MC-LR對EPC 細胞活力的影響，同時對MC-LR 暴露后的EPC 細胞顯微結構和超微結構進行觀察，以期為進一步研究MC-LR對魚類上皮細胞的影響的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鯉魚EPC細胞由江西師范大學付建平老師饋贈。M199培養基、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）及胎牛血清（FBS）購于BioInd 生物科技公司。青鏈霉素混合液（青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/L）、二甲基亞砜（DMSO）及MTT 購于索萊寶科技有限公司，其中MTT 用磷酸緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，博士德生物科技公司）溶解至5×103mg/L，經0.22μm濾膜過濾除菌后保存于-20 ℃備用。2.5%戊二醛、1%鋨酸和丙酮等電鏡切片制作所用試劑購于賽維爾生物科技有限公司。MC-LR（純度＞95%，Taiwan Algal Sci?ence Inc）用超純水溶解至1×103mg/L的母液保存于-20 ℃備用，使用前用細胞培養液（含10%FBS、1%青鏈霉素混合液和89%M199培養基）稀釋至所需濃度。

1.2 細胞培養

將細胞凍存管置于28 ℃水浴鍋中迅速解凍細胞，加入PBS后離心收集細胞，棄上清，再用PBS洗2～3遍后加入細胞培養液，吹散細胞制成單細胞懸液，將細胞懸液接種在75 cm2的細胞培養瓶中，置于28 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，每2～3 d更換培養液。待培養瓶中的細胞密度生長至90%左右時，即可使用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代至96孔培養板中培養。

1.3 MTT法檢測細胞活力

將EPC 細胞以1.2×104個/孔接種于96 孔板中，于培養箱中培養至細胞鋪滿孔底，隨后棄去培養液，再分別加入0.05，0.5，5，50 mg/L MC-LR的細胞培養液于96孔板中，同時設置空白組和對照組，每組設5個復孔。繼續培養24 h 后，棄去培養液。每孔加入100μL 培養液和20μL MTT，在培養箱中孵育4 h 后將培養液吸去，然后加入150μL DMSO，繼續放入培養箱中孵育10 min。待孔板中的甲臢溶解后，用酶標儀在570 nm 波長處測定各孔吸光值，根據OD570值計算細胞活力（%）。同時，采用SPSS 25.0 軟件進行線性回歸分析，將試驗組細胞活力（%）作為響應頻率，對照組細胞活力（100%）作為總數，MC-LR 處理濃度作為協變量，獲得MC-LR對EPC細胞的IC50（24 h）。細胞活力（%）計算公式如下：

1.4 電鏡切片制作與觀察

將EPC 細胞以4×105個/孔接種于6 孔板中培養，待孔板中的細胞鋪滿孔底后，分別加入0、4.5 mg/L（1/4IC50）和18 mg/L（IC50）MC-LR的培養液培養24 h后，在倒置顯微鏡（江南XD-202）下觀察并拍照。棄去培養液，先用PBS 洗2～3遍后，再用胰蛋白酶消化并收集細胞，接著再用PBS 洗1～2遍，隨后加入2.5%戊二醛4 ℃下預固定4 h，再用PBS 沖洗，然后用1%鋨酸溶液于4 ℃后固定2 h，再經梯度丙酮脫水，接著采用環氧樹脂812 包埋，Leica EM UC7 超薄切片機切片，最后用醋酸鈾和硝酸鉛雙染色，日立Hitachi-600透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及多重比較（Duncan），結果用“平均值±標準差”表示，以P＞0.05表示無顯著差異，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 MC-LR對鯉魚EPC細胞活力的影響

不同濃度MC-LR處理EPC細胞24 h后，細胞活力變化結果如表1所示。當MC-LR濃度為0.05 mg/L時，EPC 細胞活力與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；濃度為0.5 mg/L 和5 mg/L 時EPC 細胞活力顯著低于對照組（P＜0.05），當MC-LR 濃度為50 mg/L 時，EPC 細胞活力下降至25.138%，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。根據回歸分析計算得出MC-LR對EPC細胞的IC50（24 h）為18 mg/L。

表1 MC-LR對EPC細胞活力的影響Tab.1 Effects of MC-LR on EPC cell activity

2.2 MC-LR對鯉魚EPC細胞顯微結構的影響

分別使用0，4.5，18 mg/L MC-LR 處理鯉魚EPC細胞24 h。光學顯微鏡下觀察發現，對照組細胞呈梭形或不規則的多邊形，可以正常貼壁生長，細胞數量較多，形態比較整齊規則，細胞間距小，排列緊密（圖1A）；4.5 mg/L MC-LR 組細胞發生皺縮，并有少量細胞死亡（圖1B）；而在18 mg/L MC-LR 組中可觀察到細胞數量減少，多數細胞發生皺縮，已有部分死亡細胞失去固有形態，由多邊形或梭形變為圓形，并脫離培養瓶底部，飄浮在培養液中（圖1C）。

圖1 MC-LR對EPC細胞顯微結構的影響Fig.1 Effects of MC-LR on the microstructure of EPC cells

2.3 MC-LR對鯉魚EPC細胞超微結構的影響

利用透射電鏡觀察發現，對照組細胞胞質致密；線粒體分布廣泛，形態正常，呈卵圓形，線粒體內嵴結構清晰完整（圖2A和B）。4.5 mg/L MC-LR 組細胞內線粒體明顯腫脹，嵴排列紊亂、數目減少甚至溶解消失，呈現輕微空泡化。同時胞質內已出現少量脂滴（圖2C 和D）。18 mg/L MC-LR 組細胞胞質可見圓形脂滴增大；線粒體同樣發生腫脹，嵴溶解消失，空泡化現象嚴重（圖2E和F）。

圖2 MC-LR對EPC細胞超微結構的影響Fig.2 Effects of MC-LR on the ultrastructure of EPC cells

3 討論與結論

3.1 MC-LR對鯉魚EPC細胞活力的影響

已有研究指出MC-LR的分子量較大且分子結構復雜，通常較難通過質膜擴散進入細胞，而肝細胞和腎上皮細胞等細胞中特有的OATPs轉運系統可將MC-LR主動轉運進入細胞中[13]。因此，有關MC-LR對動物細胞活力的研究多集中在肝、腎細胞系中。在哺乳動物中，Chen等[14]曾提出0.2～12.8μmol/L MC-LR暴露24 h可導致人肝癌細胞活力受到抑制。在魚類中亦有研究表明，較低濃度MC-LR（0.001～0.1 mg/L）暴露24 h 后草魚腎細胞活力顯著提高[8]，對草魚肝細胞活力則無顯著影響[15]。近幾年來，有關MC-LR 對哺乳動物上皮細胞活力的研究也有相關報道。Kozdeba等[11]研究表明，MC-LR（10μmol/L）暴露24 h后未對人角質形成細胞活力產生顯著影響，但當暴露時間持續至48 h 或96 h 時，細胞活力顯著下降。Zhou等[16]則提出12.5～50 μmol/L MC-LR 暴露24 h 可對大鼠小腸上皮細胞活力產生顯著抑制作用。然而，MC-LR 對魚類上皮細胞活力的影響卻鮮少報道。在本研究中，0.05 mg/L MC-LR 暴露24 h 未對EPC 細胞活力產生顯著影響，當MC-LR 濃度上升至0.5 mg/L 時，EPC 細胞活力被顯著抑制。而后隨著MC-LR濃度上升，EPC 細胞活力也隨之下降，這一結果與MC-LR 在大鼠小腸上皮細胞[16]和人支氣管上皮細胞[17]中的研究類似。在Lu等[18]的研究中同樣發現，MC-LR（10～150 mg/L）處理24 h可對斑馬魚肝細胞活力產生抑制作用，且隨著暴露濃度上升，細胞活力逐漸降低。這表明MC-LR 可對多種細胞系的活性產生抑制作用，且均存在一定的劑量-效應關系。

在本研究中，MC-LR 對EPC 細胞的IC50（24 h）較低，僅為18 mg/L。而在Liu 等[19]的研究中則表明MC-LR 對小鼠卵巢顆粒細胞的IC50為34 mg/L，MC-LR 對斑馬魚肝細胞的半數最大效應濃度EC50（24 h）高達80.123 mg/L[18]。不同類型的細胞攝取MC-LR 的能力不同，這可能是導致MC-LR 對不同細胞的IC50或EC50存在差異的原因[5]。除此之外，細胞對MC-LR 的敏感程度還可能受到細胞培養條件及培養方式等因素的影響。因此，今后深入研究MC-LR 對魚類細胞的影響時，需從細胞類型、細胞培養方式或條件等方面進行綜合分析。

3.2 MC-LR對鯉魚EPC細胞顯微結構的影響

利用光學顯微鏡觀察EPC 細胞發現，對照組EPC 細胞貼壁生長，形狀較為規則整齊；4.5 mg/L MCLR組細胞形態發生皺縮并觀察到少量細胞死亡；而18 mg/L MC-LR組中可觀察到部分細胞死亡，細胞形態變圓皺縮，漂浮在培養液中。這一結果與之前對其它細胞的研究比較相似，如馬軍國[20]將MC-LR（0.5～50μmol/L）暴露于肝癌細胞24～72 h后發現，隨著MC-LR 濃度升高及暴露時間延長，細胞形態由多邊形或梭形變為圓形，細胞貼壁能力減弱并懸浮在培養基中。亦有研究表明，MC-LR（12.5、25μmol/L）暴露72 h可導致小鼠結腸癌細胞形態變圓，貼壁能力減弱[21]。以上研究表明，MC-LR可對細胞形態結構產生不利影響，今后亦可通過體內試驗進一步探究MC-LR 的細胞毒性效應。但有研究發現，人胚腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞經MC-LR（1 或5μmol/L）暴露30 min 后其顯微結構未產生明顯變化。當這兩種細胞經OATPs過表達處理后，MC-LR暴露即可導致這兩種細胞形態發生皺縮，并脫離培養板底部[22]。這表明MC-LR對細胞顯微結構的影響與細胞中OATPs含量同樣存在聯系。

3.3 MC-LR對鯉魚EPC細胞超微結構的影響

利用透射電子顯微鏡觀察EPC 細胞發現，對照組EPC 細胞胞內線粒體結構清楚，嵴排列整齊。而MC-LR 處理后的細胞胞內線粒體腫脹，嵴結構模糊，內部發生降解，空泡化嚴重。這一結果與其它研究類似，如Zhao 等[23]研究表明，鯽魚經注射MC-LR 3～48 h 后，低劑量組（20μg/kg）魚體肝臟細胞線粒體內明顯空泡化，而高劑量組（200μg/kg）則表現為線粒體腫脹，線粒體基質和嵴濃縮。Li 等[24]則提出：MCLR（200μg/kg）注射鳙魚24 h后可導致魚體肝臟細胞線粒體嵴擴張，當濃度上升至500μg/kg時則發生線粒體嵴和基質的溶解消失。在哺乳動物中同樣發現，飲用水中添加MC-LR（0.005、0.03 mg/L）3個月后小鼠肝臟細胞內線粒體出現腫脹變形、內部結構喪失，外膜破裂等現象[25]。線粒體是機體調節細胞信號通路和功能的重要細胞器，細胞分化、細胞氧化還原、蛋白質及脂類合成等生理過程都與線粒體有關[26]。同時，線粒體代謝在MC-LR 介導ROS 生成而導致細胞損傷的毒性作用機制中發揮了重要作用[27]。這些研究結果均表明線粒體是MC-LR 發揮毒性作用的重要靶標，今后還需圍繞線粒體進一步探討MC-LR對EPC細胞的毒性作用機制。

本研究中，隨著MC-LR 濃度的上升，EPC 細胞內脂滴的出現也逐漸增加。在其它研究中也觀察到了類似現象，如Li 等[28]發現當太湖中MCs 的爆發時，鰱魚肝臟中MCs 可達6.84μg/g，且其肝臟中的脂滴累積明顯。亦有學者發現鰱魚或羅非魚經注射（100μg/kg）MCs 48 h 后，其肝細胞中也可觀察到大量脂滴[29]。脂滴的形成與機體脂類合成與分解、細胞膜的形成以及多種信號傳導等過程密切相關[30]。脂滴還可作為細胞儲存脂質的場所，當細胞內營養物質不足時，機體可利用脂滴分解獲得的脂肪酸為線粒體氧化過程供能[31]。MC-LR暴露后細胞內脂滴的出現也預示了其可能對魚體細胞內脂肪的合成代謝產生了一定影響。

MC-LR 暴露可對鯉魚EPC 細胞活力產生顯著抑制作用，并且存在劑量-效應關系，此外，MC-LR 還可導致EPC 細胞形態皺縮、線粒體空泡化、脂滴的產生以及細胞死亡。本研究展示MC-LR 可能通過誘導EPC細胞線粒體損傷等機制發揮其細胞毒性效應，但具體的作用機制還需進一步探討。