江西省5個規模化豬場健康豬群中豬鏈球菌的流行病學調查及耐藥性研究

譚美芳，譚 佳，曾艷兵，楊 群，李海琴

（江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西南昌 330200）

【研究意義】近年來，隨著我國養豬業快速發展，現代豬場逐漸趨于集約化，養殖密度不斷擴大，豬的疫病特別是細菌性疫病的發生也逐漸頻繁，給養豬業的發展帶來了巨大危害，因此控制和消滅規模化豬場的常見細菌性疫病已成為當前能否促進養豬業發展的關鍵因素之一[1-2]。豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是定植于豬上呼吸道的一種具有莢膜的革蘭氏陽性球菌，主要引起豬的腦膜炎、全身性敗血癥、胸膜肺炎、關節炎和心內膜炎等，部分血清型的菌株可引起多發性漿膜炎、流產和局部膿腫，在世界范圍內流行，病發率和病死率均居高不下，是當前嚴重困擾我國生豬養殖業的常見傳染性細菌病之一[3]。因此，檢測臨床健康豬群豬鏈球菌的攜帶情況以及病原菌對抗生素的耐藥情況，對于更好地監控豬鏈球菌耐藥性、防治豬鏈球菌病以及有效防控豬鏈球菌的暴發具有重要意義。

【前人研究進展】表觀健康豬的鼻腔、扁桃體等是豬鏈球菌自然感染部位，不同日齡階段的豬對其均有易感性，其中新生仔豬、哺乳仔豬的發病率和致死率最高[4]。根據莢膜抗原成分，可將豬鏈球菌分為35個血清型（1～34、1/2），其中1、2、7 和9 型是豬的常見致病菌，而2 型豬鏈球菌被認為是分布最廣、致病性最強的一種血清型，不僅給養豬業造成巨大的經濟損失，也對人類的生命安全構成威脅[5]。目前，生豬產業主要通過滅活苗和抗生素來預防和控制豬鏈球菌的感染，但單價疫苗免疫不能對多種血清型產生交叉保護作用，所以通過抗生素治療細菌感染仍是一種常見的手段。養殖戶通過在飼料中長期添加抗生素藥物或者直接肌肉注射來預防和處理未發病或已發病的豬群[6]。近年來，由于抗生素的濫用，特別是在動物飼料中添加抗生素及在疾病治療過程中不合理用藥，很容易造成細菌敏感性降低，產生耐藥菌株，增加細菌病的治療難度，嚴重影響養豬業的發展[7]。總結2000年以來的豬鏈球菌耐藥的報道，目前我國豬鏈球菌對氧氟沙星、阿莫西林、多西環素、大環內酯類藥物、萬古霉素、林可霉素、紅霉素、大觀霉素等均表現差異耐藥性[8]。【本研究切入點】豬鏈球菌在江西省規模化豬場中的流行和耐藥情況尚不清楚。而且，當前對豬鏈球菌耐藥性的報道主要是針對發病豬群，對臨床上表觀健康豬群中攜帶的豬鏈球菌的耐藥性問題缺乏調查研究。【擬解決的關鍵問題】本研究選定江西省部分大型規模化豬場，調查臨床表觀健康豬群的豬鏈球菌流行率，對分離株進行耐藥性測定，旨在掌握該菌在省內的流行現狀，為養殖場合理用藥提供科學依據和技術支持，以期科學有效地防控豬鏈球菌病在豬場中的蔓延和流行，降低養殖成本，促進經濟效益最大化，同時從源頭上減少耐藥菌株的產生，降低耐藥菌株傳播的風險。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 健康豬群鼻拭子 樣本來自2017—2019年江西省遂川縣、南昌縣、萍鄉市和泰和縣4個市縣的5個規模化豬場。在臨床健康的保育豬群中隨機挑選豬只總計314 頭，經體積分數75%酒精棉擦拭豬鼻表面后，用無菌棉簽采集鼻液拭子總計314份。將鼻拭子保存在生理鹽水中，4 ℃冷藏運輸和保存。

1.1.2 參考菌株 本研究所用的陽性參考菌株為豬鏈球菌2型四川分離株SC19，由華中農業大學分離，本實驗保存。根據美國臨床與實驗室標準學會（Clinical and laboratory standards institute，CSLI）推薦，藥敏實驗過程中的質控菌株為金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC6538，購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

PremixTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA marker 購自大連Takara 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、哥倫比亞CNA 瓊脂基礎、5%脫纖維綿羊血購自青島海博生物技術有限公司；新生牛血清（無噬菌體低內毒素）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細菌微量生化反應管和革蘭氏陽性球菌藥敏試紙盒購自杭州濱和微生物試劑有限公司。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3 細菌分離培養及初步鑒定

用無菌接種環蘸取鼻拭子液，劃線接種至含5%脫纖維綿羊血的CNA 平板上，37 ℃恒溫培養24 h。選取具有溶血環、半透明、邊緣整齊的針尖狀小菌落進行革蘭氏染色，觀察形態。若鏡檢結果為散在的或短鏈狀的革蘭氏陽性球菌，則為可疑菌落，接種到新鮮的CNA血平板上繼續劃線純培養。細菌經過純培養后進行生化鑒定，用微量生化反應管進行糖發酵和其他生化實驗，觀察結果。選取部分疑似菌株，由武漢塞維爾生物科技有限公司通過掃描電鏡觀察細菌形態。

1.4 豬鏈球菌的PCR鑒定

用煮沸法制備細菌基因組DNA。鑒定豬鏈球菌16S rDNA 的引物、鑒定豬鏈球菌2 型cps2J基因的引物見表1。反應體系（20 μL）為：2×Taqmixture 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 6μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，共28 次循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物進行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳。在所有的PCR 反應中，SC19 的基因組用作陽性對照，ddH2O 作為陰性對照。

表1 本實驗所涉及的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 藥敏試驗

采用Kirby-Baner（KB）紙片擴散法檢測豬鏈球菌的藥敏情況：將細菌接種至含5%新生牛血清的TSA平板上，37 ℃恒溫培養24 h；用無菌棉簽蘸取3～5個單菌落，于1 mL生理鹽水中稀釋，將菌液濃度調整至0.5麥氏比濁度；另取無菌棉簽浸潤菌懸液，均勻涂布到新鮮TSA培養基表面；待平板室溫干燥5 min，用鑷子取藥敏片貼在瓊脂表面；貼好藥敏片后15 min內，將平板在37 ℃條件下恒溫倒置培養18 h。培養后取出平板，量取抑菌圈直徑，抑菌環的邊緣以肉眼看不見細菌為限，判讀結果，以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）報告。

2 結果

2.1 豬鏈球菌形態觀察

細菌在含新生牛血清的TSA固體培養基上生長良好，形成透明、濕潤、圓滑、邊緣整齊的小菌落，具有淡藍色熒光。在含5%新生牛血清的TSB培養基中培養12～24 h，呈均勻渾濁。在CNA血平板上呈現α溶血。革蘭氏染色結果顯示，豬鏈球菌在固體培養基上以單在和雙球菌為主，部分呈短鏈狀態（圖1a），在液體培養基中則以長鏈形態為主。通過掃描電鏡（50 000×）能觀察到卵圓形的細菌形態（圖1b）。

圖1 豬鏈球菌形態（標尺：0.5μm）Fig.1 Morphology of S.suis

2.2 細菌的生化鑒定

實驗結果顯示，臨床分離的豬鏈球菌菌株對葡萄糖、核糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、乳糖、棉籽糖、阿拉伯糖、七葉苷、精氨酸、MR和VP的生化反應結果差異很大，對糖的發酵不活潑，無規律不穩定，難以作為分類依據。

2.3 豬鏈球菌PCR鑒定

本研究共采集到314 份表觀健康豬群的鼻拭子樣本。通過對豬鏈球菌特異性基因（16S rDNA）的PCR 鑒定，共計有112 株疑似菌株擴增到了294 bp 的目的基因片段（圖2），證實為豬鏈球菌，檢出率35.67%。對這112株豬鏈球菌再次進行PCR 鑒定，目的基因是豬鏈球菌2型特異性基因cps2J，目的片段大小為500 bp（圖3）。此次研究未檢測到豬鏈球菌2型菌株，檢出率為0%。

圖2 豬鏈球菌16S rDNA擴增結果Fig.2 PCR amplification of S.suis 16S rDNA

圖3 豬鏈球菌2型的PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification of S.suis type 2

2.4 豬鏈球菌流行病學分析

本次調查中，表觀健康豬群中的豬鏈球菌總檢出率為35.67%，各個規模化豬場的檢出率統計學差異顯著（統計學方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）（表2）。其中，南昌的規模豬場檢出率為62.86%，顯著高于其他地區（P＜0.001），萍鄉和泰和的3家規模豬場的細菌檢出率無明顯差異（P＞0.05）。不同地區的豬鏈球菌的檢出率結果見表2。

2.5 耐藥性監測

用苯唑西林、青霉素G、紅霉素、大觀霉素、克拉霉素、萬古霉素、克林霉素、氯霉素、四環素、米諾環素、諾氟沙星、環丙沙星、左氟沙星、多粘菌素B、復方新諾明和呋喃妥因等16 種抗生素對分離鑒定出的豬鏈球菌菌株進行藥敏試驗，結果見表3。

表2 2017—2019年江西省規模化豬場中SS流行情況Tab.2 The prevalence of SS in large-scale pig farms in Jiangxi Province from 2017 to 2019

藥敏試驗結果顯示，112株豬鏈球菌對數種抗生素的耐藥情況嚴重，有96.43%的菌株對克林霉素耐藥，91.96%的菌株對四環素耐藥。其次耐藥情況比較嚴重的是：克拉霉素耐藥率66.96%、紅霉素耐藥率66.07%、大觀霉素耐藥率53.57%。對于其他抗生素，豬鏈球菌菌株表現出高度或者中度敏感性，如對萬古霉素的敏感率可達99.11%，對青霉素的敏感率達96.43%，對米諾環素的敏感率為95.54%。

表3 SS分離株的藥敏試驗結果（n=112）Tab.3 The antibiotic susceptivity profiles of SS isolates

從統計結果看，地域因素對豬鏈球菌耐藥的影響也非常明顯（表4）。5個規模化豬場分離的菌株，除對克林霉素、米諾環素、四環素和萬古霉素的耐藥或者敏感情況一致外，對其余12種抗生素的耐藥率差異較大。以紅霉素為例，5個豬場的耐藥率分別為58.33%、36.36%、75.00%、95.00%、92.86%，差異非常顯著（統計學方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）。豬場A、豬場B、豬場D 與豬場E 都分離出對左氟沙星、環丙沙星、氯霉素、苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明耐藥的菌株，豬場C 則未分離出對這6 種抗生素耐藥的菌株。從該豬場分離出的菌株，對紅霉素、大觀霉素的耐藥率也與其他四家豬場的差異顯著。此外，在豬場B和豬場E均分離到對青霉素G耐藥的菌株，其余3家豬場則沒有分離到。

表4 不同規模化豬場的SS耐藥情況分析Tab.4 Analysis of SS antibiotic-resistance results in different pig farms

2.6 豬鏈球菌多重耐藥檢測結果

表觀健康豬群所攜帶的豬鏈球菌的耐藥譜以多重耐藥為主。如表5所示，檢測的112株細菌中，5重耐藥菌有26株，占比23.21%；6重耐藥菌有28株，占比25.00%；7、8、9重耐藥菌的占比也較高。在此次試驗中，從豬場B分離出的編號為SS040的菌株，對左氟沙星、環丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環素、復方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素等11種抗生素耐藥，對氯霉素和米諾環素2種抗生素中介。從豬場E分離出的編號為SS100的菌株，對左氟沙星、環丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環素、復方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素、大觀霉素等12種抗生素耐藥。

112 株豬鏈球菌中，地域因素對豬鏈球菌耐藥譜的影響也非常明顯，來自相同豬場的菌株的耐藥譜比較接近，不同豬場間的耐藥譜差異較大。5家豬場分離出的豬鏈球菌普遍對克林霉素和四環素耐藥。除此之外，豬場A的12株分離菌主要對紅霉素、克拉霉素和大觀霉素耐藥；豬場B的44株分離菌主要對左氟沙星、環丙沙星、苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明、呋喃妥因和大觀霉素耐藥；豬場C的8株分離菌主要對呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場D的20株分離菌主要對左氟沙星、環丙沙星、呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場E的28株分離菌主要對苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明、紅霉素和克拉霉素耐藥。

表5 SS菌株的多重耐藥性情況分析Tab.5 Analysis of multiple drug resistance of SS strains

3 討論與結論

伴隨我國養豬業集約化程度越來越高，細菌性疾病的發生趨勢逐漸復雜[1]。豬感染豬鏈球菌的病例也被頻繁報道[5,9]。豬鏈球菌屬于條件性致病菌，作為常在菌群可被感染豬、康復豬或健康豬攜帶。在一個被豬鏈球菌嚴重污染過的豬場，豬的帶菌率可達100%，但該病的發病率不同時期各不相同，通常情況下低于5%[10]。近幾年來，我國廣大農牧區及許多養豬場出現了來勢猛烈、傳播快、病程短、死亡率高的敗血型鏈球菌病，造成了重大的經濟損失[10]。南京農業大學對華南地區屠宰群中豬鏈球菌的流行病學調查結果顯示，401 份屠宰豬的扁桃體的陽性檢出率38.4%[11]。華中農業大學動物疫病診斷中心對全國21 個省市送檢的12 452 份臨床病料進行細菌分離和鑒定，從中分離到致病菌3 926 株，其中豬鏈球菌占所分離細菌總數37.42%[12]。本研究對江西省省內規模化豬場進行豬鏈球菌的流行病學調查，發現豬鏈球菌在臨床健康豬群中的檢出率為35.67%，與上述大規模的豬鏈球菌流行病學調查數據一致。另外，本次調查中表觀健康豬群的鏈球菌2型檢出率為0%。2011—2012年，江西省疾病預防控制中心在曾發生過豬鏈球菌感染人的景德鎮市和崇仁縣開展健康豬攜帶豬鏈球菌的狀況調查，從301份鼻拭子和扁桃體樣品中分離2株豬鏈球菌2型，分離率也僅為0.66%[13]。據江蘇省獸醫研究所報告，江蘇地區健康豬群對豬鏈球菌2型42.6%的攜帶率[14]，這與上述兩次江西省的調查數據差異較大，可能是因為地區差異。

從臨床用藥的角度看，豬鏈球菌菌株對萬古霉素的敏感率最高，但是因為萬古霉素對機體的副作用較大（神經損傷、腎功能損傷等），一般不建議作為抗生素療法的首選。β-內酰胺類抗生素（青霉素G）作為臨床上長期使用的殺菌藥物，仍然對豬鏈球菌保持著高度敏感性，是理想的治療或者預防豬鏈球菌病的抗生素。

過度使用抗生素而引起細菌耐藥發展速度加快是一個共識，抗生素的常態化使用（飼料添加劑，消毒劑，食品和飼料的防腐劑或凈化劑）被認定是耐藥菌產生和耐藥基因傳遞的主要因素[15]。研究數據表明，國內豬鏈球菌對臨床使用頻率較高的抗生素耐藥情況嚴重，主要有四環素、大環內酯類、頭孢菌素類、喹諾酮類以及磺胺類抗生素，并且出現了大量多重耐藥株[16]。本次試驗結果表明，省內豬鏈球菌的耐藥情況已相當嚴峻。分離出的112株豬鏈球菌，至少對1種抗生素耐藥，多重耐藥菌株占大多數，甚至出現了11 重、12 重耐藥菌株。幾乎全部的菌株都對四環素耐藥，可能是由于四環素類抗生素被廣泛用于飼料添加劑，超標的劑量導致細菌選擇性進化，耐藥情況嚴重。此外，藥敏試驗結果顯示，已有耐青霉素的菌株出現，不容樂觀。耐藥菌株往往在抗生素超標使用的“選擇性壓力”下出現，因此強化養殖從業人員科學合理使用抗生素的意識非常重要。

通過此次調查結果可以看出，各個規模化豬場的豬鏈球菌流行率和耐藥率差異較大，從側面反映出各個豬場養殖模式和管理的差異性，例如在日常生產過程中抗生素的選擇、使用情況等。為預防豬鏈球菌的發生，豬場應注意改善環境條件，加強飼養管理，盡量減少致病的應激因素[17]。臨床癥狀出現時，若選擇了對細菌不敏感的抗生素，導致治療過程費時費力，無效且增加成本，更易產生耐藥性[12]。因此，有條件的規模化豬場可以考慮定期分離菌株，進行藥敏試驗，一旦發病，盡快選擇敏感藥物合理使用，同時在發病期間對整個豬群進行藥物預防，使疫病得到有效控制，減少損失。規模化豬場應高度重視細菌耐藥性問題，通過實驗室摸清豬場致病菌種類，建立完善、合理的細菌性疾病監測方案，防患于未然。

致謝：華中農業大學胡巧博士和合作豬場對本研究給予了支持和幫助，謹致謝意!