高鈣高蛋白日糧對肉仔雞生長性能、血清生理生化指標和盲腸菌群的影響

王 志 ，胡仲皓，賀濛初，桂雪兒，朱 杰，馮士彬，李錦春，吳金節*

（1.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036；2.安徽省宣城市木子禽業專業合作社，安徽宣城 242000）

【研究意義】高尿酸血癥（hyperuricemia）和痛風（gout）是嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少所引起的一組異質性疾病[1]，飲食[2]、基因[3]或者疾病[4-5]相關的尿酸產生過多是高尿酸血癥的基礎。高尿酸血癥和痛風誘因很多，常見的有高蛋白、高鈣日糧[6]，維生素A缺乏，飲水不足，霉菌毒素中毒[7]等。【前人研究進展】駱建兵、朱小甫等[8-9]已證實，日糧中過高的蛋白質和鈣會導致尿酸代謝障礙，引發雞痛風?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，高通量測序技術在盲腸微生物研究中得到廣泛運用，逐漸成為研究復雜盲腸菌群最為有效的手段之一[10]?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過在肉仔雞日糧中添加高鈣、高蛋白日糧，構建雞高尿酸血癥模型，運用高通量測序技術分析仔雞盲腸菌群的變化，同時檢測反映雞肝腎功能的主要血清生理生化指標，觀察病理組織學變化，探討高鈣高蛋白日糧對雞生長性能、肝腎功能、血清抗氧化指標及盲腸菌群的影響，為臨床上禽高尿酸血癥和禽痛風的防治提供試驗資料。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

取同批次體質量相近的健康1日齡的817肉仔雞160只，隨機分為4組，每組5個重復，每個重復8只雞。4組分別為對照組（CP含量21%，Ca含量1%），高蛋白組（CP含量31%，Ca含量1%）、高鈣組（CP含量21%，Ca含量5%）和高蛋白+高鈣組（CP含量31%，Ca含量5%）。日糧組成及營養水平見表1。試驗雞采用地面平養，自由采食和飲水。各組雞均按照常規飼養操作規程和免疫程序進行飼養和免疫。

1.2 樣品采集和保存

在試驗第21 天時各組隨機取6 只雞屠宰，收集肝、腎等組織及盲腸內容物。宰前禁飼12 h，禁飼期自由飲水。

表1 日糧組成及營養水平（風干基礎）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）%

1.3 測定指標

1.3.1 生長性能 每周測定各組肉仔雞采食量、體增質量，計算的平均日采食量（g/d）、平均日增質量（g/d）和料重比（F/G）。

1.3.2 血液測定指標 分別于試驗的第10 天、第21 天頸靜脈采血，分離血清，-20 ℃保存。血液生化指標用邁瑞BS-220全自動生化分析儀測定，嚴格參照深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供的試劑盒使用說明檢測血液中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、肌酐（CREA-S）活性或含量。

使用MK3型半自動酶聯免疫分析儀（Thermo，美國）測定血清中超氧化物歧化酶（SOD），黃嘌呤氧化酶（XOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）的活性或含量。所有試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司，試驗嚴格按照試劑盒的說明書步驟操作。

1.4 盲腸菌群高通量測序

1.4.1 DNA 提取和16S rRNA 基因擴增PCR 反應 內容物等量混合用于DNA 提取。用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒抽提仔雞盲腸內容物總基因組DNA，采用引物338F（5'-ACTCCTAGGGAGGCAGG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3'）擴增細菌16S rRNA基因v3-v4區。

1.4.2 PCR 反應和高通量測序分析 采用Illumina Miseq 高通量測序技術對肉雞盲腸微生物16S rRNA基因的v3-v4區進行了測序，獲得的序列通過FLASH（v1.2.8）軟件平臺，根據雙端序列的overlap 關系，將序列拼接成長的tag，并將序列上建庫引入的barcode 和引物序列去除，然后采用Vsearch（v2.3.4）過濾嵌合體。預處理之后的cleandata使用Vsearch將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OTU，挑選最佳的centroids（位于幾何中心）序列作為該OTU 的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析alpha 多樣性。使用blast進行序列比對，將OTU代表序列與RDP（核糖體數據庫）以及NCBI-16S數據庫對每個代表性序列進行物種注釋。各組樣品進行菌群多樣性分析和聚類分析，對樣品的各個細菌門組成進行統計，得到菌群分析結果。

1.5 PICRUSt功能預測及數據處理

使用Picrust 2.0.0從16S rRNA數據中預測元基因組功能。運用STAMP軟件包對元基因組進行統計分析。數據均用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高鈣高蛋白日糧對1～21日齡肉仔雞生長性能的影響

由表2可知，仔雞21日齡時，對照組雞的平均體質量、日增質量、日采食量均極顯著高于其他3組（P＜0.01），料重比極顯著小于高鈣高蛋白組（P＜0.01）；高蛋白組雞的平均體質量、日采食量顯著高于高鈣組和高鈣高蛋白組（P＜0.05）；高鈣組雞的平均體質量、日增質量顯著高于高鈣高蛋白組（P＜0.05）而料重比顯著小于高鈣高蛋白組（P＜0.05）。

表2 高鈣、高蛋白日糧對21日齡肉仔雞生長性能的影響Tab.2 Effects of high calcium and/or high protein diets on performance of 21-day-old broilers

2.2 高鈣、高蛋白日糧對10、21日齡肉仔雞血清生化指標的影響

由表3可知，仔雞10日齡時，與對照組相比，高蛋白組雞的UA、CREA-S的含量極顯著升高（P＜0.01），高鈣組雞的AST 的活性顯著升高（P＜0.01），高鈣高蛋白組雞的AST、CREA-S、UA、UREA 的活性或含量極顯著升高（P＜0.01）；與高蛋白組相比，高鈣組與高鈣高蛋白組雞的UA 含量極顯著升高（P＜0.01）；與高鈣組相比，高鈣高蛋白組雞的UA 含量極顯著升高（P＜0.01）。仔雞21 日齡時，與對照組相比，高蛋白組、高鈣組與高鈣高蛋白組雞的AST、ALT、UA、CREA-S、UREA 的活性或含量極顯著升高（P＜0.01），且高鈣高蛋白組雞的AST、ALT、UA、CREA-S的活性或含量極顯著高于高蛋白組（P＜0.01）。

2.3 高鈣、高蛋白日糧對仔雞血清自由基代謝的影響

由表4可知，仔雞10日齡時，與對照組相比，高鈣組與高鈣高蛋白組仔雞血清中T-AOC 的活性顯著升高（P＜0.05），蛋白組、高鈣組與高鈣高蛋白組仔雞血清中MDA、XOD、SOD 含量或活性顯著（P＜0.05）或極顯著升高（P＜0.01），3組試驗組之間無顯著差異仔雞（P＞0.05）；21日齡時，與對照組相比，蛋白組、高鈣組與高鈣高蛋白組仔雞血清中MDA、XOD、SOD 含量或活性極顯著升高（P＜0.01），高鈣高蛋白組仔雞血清中GSH-Px的活性極顯著降低（P＜0.01）；高鈣組與高鈣高蛋白組仔雞血清中SOD活性與高蛋白組相比顯著升高（P＜0.05）。

表4 高鈣、高蛋白日糧對肉仔雞血清自由基代謝的影響Tab.4 Effects of high calcium and/or high protein diets on serum free radical metabolism in Broilers

2.4 高鈣、高蛋白日糧對肉仔雞盲腸菌群的影響

2.4.1 肉雞盲腸微生物物種豐度及多樣性 本研究對12 份雛雞盲腸內容物樣品進行了Illumina Miseq高通量測序，共得到有效序列587 884 條。在97%的相似水平下對序列進行OTU 的聚類，統計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產生15 260個OTU。對于菌群而言，Alpha多樣性代表每個樣品中菌群的多樣性，通過多種指數可以反映樣品中菌群的多樣性。Simpson 指數和Shannon 指數來估算樣品中微生物多樣性，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數越大，說明群落多樣性越低。從表5 可以看出，高蛋白組的物種豐富度極顯著高于對照組、高鈣組、高鈣高蛋白組（P＜0.01）；高鈣高蛋白組的Shannon值顯著低于對照組（P＜0.05），其他3組Shannon值相近；各組Simpson無顯著差異。

表5 雛雞盲腸微生物物種豐富度及α_多樣性指數的比較Tab.5 Comparison of intestinal microbial species richness and alpha diversity index of broilers

2.4.2 不同狀態下盲腸微生物菌群組成分析 利用軟件Vsearch 對12 個樣品測得的序列在大于97%相似性條件下進行聚類，挑選最佳的centroids（位于幾何中心）序列作為該OTU 的代表序列，用于后續物種分類注釋。共將測得的雛雞盲腸內容物中所有菌群分為7 個菌門，厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacte?roidetes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、軟壁菌門Tenericutes、藍細菌門Cyanobacteria、黏膠球形菌門Lentisphaerae。各組的優勢菌門分別是變形菌黏膠球形菌門門、擬桿菌門和厚壁菌門，這3 個菌門的相對豐度占分別總序列的98.37%～99.73%。在對照組、高蛋白組、高鈣組、高鈣高蛋白組中，厚壁菌門分別占總序列的平均值為60.8%、51.7%、52.39%和48.42%；擬桿菌門分別占總序列的平均值為37.58%、45.79%、43.69%和42.74%；變形菌門分別占總序列的平均值為1.28%、2.13%、2.95%和8.55%；在屬水平上，優勢菌屬為厭氧桿菌屬，在對照組、高蛋白組、高鈣組、高鈣高蛋白組中，分別占總序列的平均值為28.12%、14.16%、14.13%和1.36%；其次是糞便桿菌和疣微菌屬，分別占總序列的平均值為13.50%、6.74%、1.92%和3.61%和6.18%、5.8%、12.03%和9.11%。

2.4.3 不同狀態下盲腸微生物差異菌群比較 分析比較各組OTU 值大于0.02%時的菌門所占比例的變化（表6）。發現在門水平上，與對照組相比，高蛋白組、高鈣高蛋白組的厚壁菌門所占總序列的比例顯著減少（P＜0.05）；高鈣、高鈣高蛋白組的變形菌門所占總序列的比例顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）增加;而相比于高蛋白組，高鈣高蛋白組的變形菌門所占總序列的比例顯著（P＜0.05）增加。在屬水平上，與對照組相比，高蛋白組的厭氧桿菌屬、糞便桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬第十八類群、嗜堿菌所占總序列的比例顯著（P＜0.05）或極顯著減少（P＜0.01），而另枝菌屬、顫桿菌克屬所占總序列的比例顯著（P＜0.05）或極顯著增加（P＜0.01）；高鈣組的梭狀芽孢桿菌屬第十八類群所占總序列的比例顯著減少（P＜0.05），而卟啉單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌所占總序列的比例顯著增加（P＜0.05）；高鈣高蛋白組梭狀芽孢桿菌屬第十八類群、厭氧桿菌屬、糞便桿菌屬所占總序列的比例顯著（P＜0.05）或極顯著減少（P＜0.01），而另枝菌屬、理研菌屬、卟啉單胞菌屬所占總序列的比例顯著（P＜0.05）或顯著增加（P＜0.01）；相比高蛋白組與高鈣組，高鈣高蛋白組的厭氧桿菌屬所占總序列的比例極顯著（P＜0.01）降低，且高蛋白組的卟啉單胞菌屬所占總序列相比高鈣高蛋白組顯著降低（P＜0.05）。

表6 在門與屬水平上各組顯著差異的序列Tab.6 Sequences of significant differences among groups at Phylum and Genus levels

2.4.4 菌群代謝功能預測 PICRUSt是通過微生物群落的豐富度與數據庫比，從而在不可觀測的情況下推測出生物群落的功能信息[9]。本試驗基于Greengenes 16S rRNA 數據庫結果獲得442 個預測的功能。運用STAMP軟件對數量前20的功能進行分析，結果顯示：與對照組相比，糖酵解Ⅱ、戊糖磷酸途徑（非氧化值分支）、卡爾文-本森-巴沙姆循環、戊糖磷酸途徑等的功能基因在高蛋白組偏低，中乙?；hⅡ在高蛋白組中偏高；戊糖磷酸途徑、戊糖磷酸途徑（非氧化值分支）等的功能基因在高鈣組中偏低，腺苷脫氧核糖核苷酸從頭合成Ⅱ、腺苷核苷酸從頭合成超途徑I、鳥苷脫氧核糖核苷酸從頭合成Ⅱ、腺苷脫氧核糖核苷酸從頭合成Ⅱ、TCA 循環I 等的功能基因在高鈣組中偏高，鳥苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、L-異亮氨酸從頭合成超途徑I、糖酵解Ⅲ等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏低，L-異亮氨酸從頭合成超途徑I、鳥苷核苷酸從頭合成超途徑I、腺苷核苷酸從頭合成超途徑I、腺苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、乙?；hⅡ、嘧啶核苷從頭合成的超路徑等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏高；與高蛋白組相比，肌苷5，-磷酸降解等的功能基因在高鈣組中偏高；L-異亮氨酸生物合成的超途徑I、糖酵解Ⅱ（來自6-磷酸果糖）、腺苷核苷酸從頭合成超途徑I、腺苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、鳥苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、賴氨酸生物合成Ⅲ、賴氨酸生物合成Ⅳ等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏高，嘧啶核苷從頭合成途徑、糖酵解Ⅲ、鳥苷核苷酸從頭合成超途徑I 等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏低；與高鈣組相比，L-異亮氨酸生物合成的超途徑I、糖酵解Ⅱ（來自6-磷酸果糖）、肌苷5’-磷酸降解、腺苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、鳥苷核苷酸從頭合成超途徑Ⅱ、L-精氨酸的生物合成（乙酰基循環）等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏低；腺苷核苷酸從頭合成超途徑I、鳥苷核苷酸從頭合成超途徑I 等的功能基因在高鈣高蛋白組中偏高結果如圖1 所示。

圖1 預測功能基因在對照組和實驗組之間的差異（二級功能層）Fig.1 The variation of predicted functional profiles between control and experimental groups（hierarchy level 2）

2.5 試驗雞肝臟、腎臟的HE染色結果

顯微鏡觀察發現，對照組組仔雞的肝臟（圖2A）和腎臟（圖2E）組織正常；高蛋白組仔雞的肝臟組織有炎性細胞浸潤及空泡變性（圖2B），腎臟組織腎小球萎縮（圖2F）；高鈣組組仔雞的肝臟組織壞死及空泡變性（圖2C），腎臟組織腎小球萎縮、炎性細胞浸潤（圖2G）。高鈣高蛋白組肝臟組織肝細胞崩解、壞死、肝細胞空泡化程度加深（圖2D）；腎小球萎縮，腎小管上皮細胞空泡化、腎小管上皮脫離基底膜、崩解（圖2H）。

圖2 肉雞肝臟和腎臟HE染色后的顯微照片（放大倍數：100）Fig.2 Microscopic pictures of broiler liver and kidney after HE staining（Magnification：100）

3 討論與結論

3.1 高鈣高蛋白日糧對仔雞生長性能的影響

試驗期間，對照組仔雞日均采食量正常，體質量平穩上升，其精神狀態、行為狀態良好。高蛋白組采食量減少。高鈣組仔雞日均采食量較為平穩，排泄白色稀便，站立困難。高鈣高蛋白日糧組仔雞采食量嚴重下降，生長性能嚴重降低，基本處于生長停滯階段，仔雞精神萎靡，站立困難，拉白色稀糞。而且高鈣組及高鈣高蛋白組對仔雞生長性能的不良影響高于高蛋白組。

3.2 高鈣高蛋白日糧對仔雞血清自由基代謝的影響

高鈣高蛋白日糧能引發痛風[11]，本試驗對飼喂高鈣高蛋白日糧雞血液部分生化指標的影響進行了動態觀察，旨在探討和禽痛風密切相關的肝腎功能異常在尿酸代謝中的作用。

仔雞10 日齡時，高鈣組與高鈣高蛋白組血清AST 的活性顯著提高表明這兩組的雞肝臟代謝異常，3 組實驗組血清UA、CREA-S 的含量顯著升高表明高鈣、高蛋白日糧的加入可導致腎臟尿酸排泄障礙，造成腎臟損傷，甚至引起高尿酸血癥[12]；仔雞21 日齡時，高鈣組與高鈣高蛋白組血清AST 及ALT 的活性顯著提高表明這兩組的雞肝臟受到的損害加劇，而3組試驗組血清UA、CREA-S 的含量顯著升高表明高鈣、高蛋白日糧持續損害著雞的腎臟，造成腎損傷加重，引發3組試驗組的雞的高尿酸血癥。

3.3 高鈣高蛋白日糧對仔雞血清自由基的影響

機體的氧化與抗氧化處于一種動態平衡，但在患病或衰老等狀態下，會出現由于自由基水平升高而導致的病理現象[13]。在試驗的第10 天，高蛋白組血清中MDA 含量顯著升高，反映氧自由基對細胞造成了一定程度的損傷[14]；高鈣組與高蛋白組血清中的MDA 含量和XOD 的活性顯著提高表明此階段催化產生大量氧自由基，生成更多的尿酸和氧自由基[15]，從而引起組織的損傷，而血清SOD 活性的提高這可能是機體抗氧化系統對高尿酸血癥的代償性反應[16]。在試驗的第21天，試驗組雞血清MDA含量與XOD的活性顯著提高及GSH-Px活性的顯著降低表明氧自由基對細胞造成了持續性的損害。

3.4 高鈣、高蛋白日糧對仔雞盲腸菌群結構的影響

本研究應用IlluminaMiseq高通量測序分析了飼喂高鈣、高蛋白日糧對21日齡仔雞盲腸菌群的影響。通過物種注釋可以看出，含量排在前五的門分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、藍細菌門、放線菌門，這一結果與Shaufi 等人[17]的研究結果相似。本研究表明，厚壁菌門是健康雞的盲腸中含量最多的菌群。據報道，厚壁菌門與粗飼料的消化有關，雞作為以植物為主要食物禽類，厚壁菌門對其營養消化吸收有幫助作用，而變形菌門的增加常發生在胃盲腸炎癥的宿主[18]。在本試驗中，高鈣組及高鈣高蛋白組的厚壁菌門均顯著減少，變形菌門均顯著增加說明高鈣及高鈣高蛋白日糧影響了雞對營養物質的吸收，可能引起了雞的盲腸炎癥。而本研究中也發現盲腸中微生物的優勢有益菌群發生改變，如厭氧桿菌屬和糞便桿菌屬；PICRUSt 功能預測結果顯示對照組與試驗組雞的盲腸菌群功能組成差異顯著，且高蛋白組和高鈣組雞的盲腸菌群功能組成與高鈣高蛋白組之間差異顯著。表明高鈣、高蛋白日糧破壞了仔雞盲腸菌群的結構，使得葡萄糖代謝和一些氨基酸和核苷酸的合成代謝出現紊亂，且飼喂高鈣高蛋白日糧對雞盲腸菌群的不良影響大于飼喂高蛋白日糧和高鈣日糧。

3.5 高鈣、高蛋白日糧對仔雞肝、腎組織病理變化的影響

肝臟是尿酸的生成器官，而腎臟是尿酸的排泄器官[19]，當這些器官受到損傷時，就會導致尿酸代謝障礙[20]。本試驗中，各試驗組日糧均導致仔雞肝腎不同程度的損傷，表明高蛋白、高鈣、高鈣高蛋白日糧對肝腎組織均有損害作用。

本研究表明，高鈣高蛋白日糧導致仔雞生長性能、抗氧化能力降低，肝腎功能受損，引起仔雞高尿酸血癥及盲腸菌群紊亂。