不同貯藏溫度對糙皮側耳冷藏后貨架期品質和細胞壁變化的影響

李甜竹，劉 熙，王政鈞，孫玉文，郝永勝，伊亮輝，胡克玲

（安徽農業大學園藝學院，安徽合肥 230036）

【研究意義】糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）俗稱平菇，是我國栽培最廣泛的食用菌之一。由于其子實體表面缺乏保護結構，導致采后糙皮側耳極易受到機械損傷，表現為質地變軟、褐變、水分流失等，嚴重縮短了糙皮側耳的貨架期[1-2]。低溫貯藏是目前國內外食用菌保鮮最常用的方法之一。低溫抑制菌柄伸長、菌蓋開傘，減緩酶活性和微生物生長，降低呼吸作用，防止食用菌采后失水，減少失重率和干物質的損耗，有效抑制蛋白質的分解[3]。在低溫貯藏下，糙皮側耳的貯藏壽命從常溫1～3 d 延遲到10 d 左右[4]。園藝產品的貨架壽命是實現自身經濟價值極其關鍵的時刻[5]，而溫度又是影響園藝產品貯運保鮮和貨架期保鮮效果的關鍵因子[6]，當產品從貯藏環境轉運至貨架上時，其生理上發生著一系列的變化，這些變化在貯藏期不易被察覺，但在貨架期會明顯地表現出來[7]。【前人研究進展】早期研究[8]表明，當貯藏溫度從2 ℃上升到18 ℃，糙皮側耳的呼吸速率迅速增加。對比10 ℃貯藏條件，0 ℃低溫保鮮的糙皮側耳蒸騰速率降低了約1/3[9]。低溫影響采后園藝產品細胞壁顯微、超微結構變化，推遲細胞壁膨脹等衰老現象的發生，使細胞壁得到保護[10]。譚志勇等[11]對食用菌不同貯藏保鮮效果的研究表明，低溫使食用菌的保鮮時間明顯延長。低溫貯藏過程中發生的木質化現象，導致貯藏產品硬度增加，質地變差，且只有當轉入常溫貨架期間才明顯地表現出來。研究發現，0 ℃冷藏后貨架期的華山梨由于失水萎蔫，導致果柄干枯、褐變[12]。蘋果冷藏期及貨架期生理品質變化的研究表明，冷藏后室溫貨架的果實較冷藏果實硬度更低[13]。隨著冷藏時間的延長，藍莓果實MDA 含量在貨架期顯著增加，膜脂過氧化程度加劇[14]。【本研究切入點】目前，關于園藝產品采后保鮮技術的研究多集中在貯藏過程，較少涉及冷藏后貨架期產品品質的變化情況。因此，探究不同貯藏溫度對糙皮側耳冷藏后貨架期品質和細胞壁變化的影響尤為重要，以期為糙皮側耳的保鮮、貯藏及加工運輸提供更加全面的參考依據。【擬解決的關鍵問題】本研究通過設置不同貯藏低溫，對糙皮側耳進行冷藏處理，隨后轉入常溫貨架期，分析貨架期間兩種冷藏溫度對糙皮側耳的外觀品質、抗氧化能力、細胞壁水解酶活性以及細胞壁結構變化的影響，探究不同貯藏溫度對糙皮側耳冷藏后貨架期品質和細胞壁變化的影響。以期為糙皮側耳的貯藏、保鮮及運輸加工提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗新鮮糙皮側耳采自安徽農業大學食用菌培養中心，品種為‘早秋615’。選取菌蓋充分展開，邊緣緊收，菌蓋直徑5 cm左右，自然色澤，下凹部分開始出現白色毛狀物的糙皮側耳適時采收，采后迅速運往實驗室進行相關處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 本試驗共分為2 個處理：（1）1 ℃低溫處理：糙皮側耳存放于聚乙烯（PE）保鮮袋中，自然敞口，放入1 ℃冰箱中貯藏；（2）5 ℃低溫處理：糙皮側耳在自然敞開的PE保鮮袋中于5 ℃冰箱中貯藏。2 個處理的試驗材料分別貯藏6 d 后，轉至模擬貨架期（20 ℃）溫度的恒溫培養箱中貯藏3 d，每天測定相關指標。

1.2.2 測定項目及方法 （1）硬度。硬度測定使用CT3質構儀進行檢測，方法采用TPA 質構分析對糙皮側耳菇蓋進行測定分析，設置目標為4.0 mm、觸發點負載0.07 N、測試速度0.50 mm/s、返回速度0.5 mm/s、探頭選取TA44型號、夾具選取TA-RT-KIT型號。

（2）失重率。將糙皮側耳平均稱質量，每個處理分成4份，每天測定質量變化。

失重率（%）＝（貯藏前質量-貯藏后質量）/貯藏前質量×100%。

（3）MDA 含量。參考曹健康等[15]的方法做適當修改。取0.5 g 樣，研磨并定容至5 mL，4 500 r/min 離心10 min，提取上清液加TBA，沸水浴10 min 迅速冷卻，4 500 r/min 下離心10 min，取上清液測OD532和OD600吸光度。

（4）POD、CAT 活性。參照Hu 等[16]的方法。取0.5 g 樣，加PBS 研磨成勻漿，4 000 r/min 離心15 min，上清液為粗酶提取液，用來測定POD 和CAT 活性。POD 活性測定：加入3 mL 反應混合液和1 mL 酶液，混合液加PBS 作為對照，立即秒表計時，測OD470吸光度，以每分鐘A470變化0.01 為一個POD 活性單位（U）。CAT活性測定：反應液為0.2 mL粗酶液加1.5 mL PBS和1 mL蒸餾水，對照管沸水浴1 min。逐管加入1 mol/L H2O2，立即秒表計時，測OD240吸光度，以每分鐘A240變化0.01為一個CAT活性單位（U）。

（5）Cx 活性。參照劉德海等[17]的方法做適當修改。取0.5 g 樣，用蒸餾水研磨并定容至25 mL，酶液稀釋10 倍。取4 支試管，各加入羧甲基纖維素鈉溶液2 mL，50 ℃保溫3 min，向空白管加入DNS 2.5 mL，測定管各加入酶液0.5 mL，立即50 ℃保溫30 min，再于空白管中加0.5 mL 酶液。3 支樣品管各加2.5 mL DNS，沸水浴10 min，以空白管調零，測OD540吸光度值。

（6）糙皮側耳石蠟切片制作。每隔24 h從20 ℃恒溫培養箱中各取1 ℃、5 ℃低溫處理糙皮側耳1枚，在菌蓋處剪下0.5 cm×0.5 cm 大小部位，放入標本瓶。倒入FAA 固定液浸沒材料，于4 ℃冰箱中固定24 h以上。隨后將糙皮側耳組織取出，將目的部位組織修平整放于脫水盒內，將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水浸蠟。將浸好蠟的糙皮側耳組織于包埋機內進行包埋，最后將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，用苯胺藍染液對切片進行染色，中性樹膠進行封片[28]。

1.2.3 數據分析 采用Excel 和SPSS17.0 進行作圖和數據差異顯著性分析。數據在0.05 水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對糙皮側耳硬度的影響

由圖1 可知，隨著貯藏時間的延長，兩處理的硬度均呈現下降趨勢。5 ℃冷藏的糙皮側耳在貨架期3 d 內緩慢下降，且貯藏1 d 后硬度高于1 ℃貯藏糙皮側耳，差異性不顯著。1 ℃貯藏的糙皮側耳硬度在貨架期0～1 d迅速下降，隨后變化平穩。由此可知，5 ℃冷藏后的糙皮側耳在貨架期較1 ℃能更好地抑制硬度的下降，保持糙皮側耳的硬度。

2.2 不同處理對糙皮側耳失重率的影響

由圖2 可知，在貨架期間糙皮側耳的失重率始終處于上升趨勢，5 ℃處理大于1 ℃處理。在貨架期0～1 d，兩處理糙皮側耳失重率上升幅度變化差異較小，隨著貨架期的延長，5 ℃冷藏后的糙皮側耳失重率上升更快，且在貨架期第3天顯著高于1 ℃貯藏糙皮側耳。綜上可知，1 ℃低溫貯藏后的糙皮側耳能更好的抑制貨架期失重率的上升。

圖1 不同處理對糙皮側耳硬度的影響Fig.1 Effect of different treatments on the firmness of Pleurotus ostreatus

圖2 不同處理對糙皮側耳失重率的影響Fig.2 Effects of different treatments on the weight loss rate of Pleurotus ostreatus

2.3 不同處理對糙皮側耳MDA含量的影響

由圖3 可知，在貨架期間，5 ℃冷藏后的糙皮側耳MDA 含量呈現先增加后下降的趨勢且明顯大于1 ℃貯藏處理組，在貨架期第1 天達到最大峰值，隨后迅速下降。1 ℃處理組糙皮側耳MDA 含量在整個貯藏期間逐漸上升，在貨架期第3天顯著高于5 ℃處理組。由此可知，1 ℃低溫處理后的糙皮側耳在貨架期MDA含量不斷增加，在第3天超過5 ℃貯藏糙皮側耳。

2.4 不同處理對糙皮側耳POD活性的影響

由圖4可知，隨著貨架期的延長，5 ℃冷藏處理的糙皮側耳POD 活性在0～1 d迅速增加，1～2 d變化平穩，2～3 d 又快速上升。1 ℃處理的糙皮側耳在貨架期0～3 d 保持較低且平穩的變化，顯著低于5 ℃處理組。由此可知，5 ℃處理后的糙皮側耳POD活性較高，抗氧化能力較強。

圖3 不同處理對糙皮側耳MDA含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of MDA in Pleurotus ostreatus

圖4 不同處理對糙皮側耳POD活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on POD activity in Pleurotus ostreatus

2.5 不同處理對糙皮側耳CAT活性的影響

隨著貨架期時間的延長，1 ℃處理組糙皮側耳CAT活性迅速下降，在0～2 d高于5 ℃，隨后低于5 ℃處理組。5 ℃處理糙皮側耳變化平穩，在貨架期0～1 d緩慢下降，1～2 d保持平穩，2～3 d緩慢上升（圖5）。根據相關性分析，在整個貨架期間，兩處理差異性顯著。綜上所知，在貨架期前2 d，1 ℃低溫處理有更高的CAT活性，2 d后，5 ℃貯藏糙皮側耳CAT活性更高。

2.6 不同處理對糙皮側耳Cx活性的影響

由圖6 可知，1 ℃處理的糙皮側耳Cx 活性在貨架期間先增加再下降，后保持平穩。5 ℃處理在0～1 d迅速下降，1～2 d 逐漸上升，2～3 d 再次下降。在第0 天，5 ℃處理Cx 活性顯著高于1 ℃處理，隨后快速下降，且顯著低于1 ℃處理，2 d后逐漸上升超過1 ℃。在貨架期第3天，5 ℃處理再次低于1 ℃。綜上可知，在貨架期0～2 d，1 ℃低溫處理糙皮側耳能保持較高的Cx活性，貯藏2～3 d，1 ℃處理變化平穩，5 ℃冷藏后的糙皮側耳Cx活性逐漸降低且低于1 ℃處理。

圖5 不同處理對糙皮側耳CAT活性的影響Fig.5 Effects of different treatments on CAT activity in Pleurotus ostreatus

圖6 不同處理對糙皮側耳Cx活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on Cx activity in Pleurotus ostreatus

2.7 不同處理對糙皮側耳細胞壁結構的影響

由圖7可知，隨著貨架期的延長，糙皮側耳子實體細胞結構變得雜亂無序，模糊不清。在剛結束冷藏第0天時，1 ℃貯藏的糙皮側耳子實體細胞間隙較5 ℃貯藏糙皮側耳排列有序、結構更加清晰。隨著轉至常溫貨架期（20 ℃）以后，1 ℃冷藏處理糙皮側耳細胞間隙變化更明顯，排列出現雜亂無章（圖7c、7d），細胞壁胞間結構變得疏松，細胞之間相互分離。此結果與1 ℃冷藏糙皮側耳在貨架期間Cx活性更高相符合。在貨架期第3天，兩處理糙皮側耳細胞壁結構都變得模糊不清，且1 ℃處理糙皮側耳細胞壁更加雜亂，已無法分辨細胞間隙結構（圖7g、7h）。由此可知，5 ℃處理糙皮側耳在貨架期間能保持更好的細胞壁結構。

圖7 不同處理對糙皮側耳石蠟切片的影響Fig.7 Effects of different treatments on paraffin sections of Pleurotus ostreatus

3 討論與結論

糙皮側耳采后品質迅速下降，低溫貯藏能夠有效延長糙皮側耳的貯藏保鮮期，但經低溫貯藏一段時間轉入常溫貨架期，糙皮側耳的生理發生了一系列的變化。兩種溫度處理冷藏后轉入貨架期的糙皮側耳失重率迅速上升；硬度、CAT 活性呈現下降趨勢；5 ℃冷藏的糙皮側耳POD 活性逐漸上升，1 ℃糙皮側耳仍保持在極低的狀態；1 ℃處理的糙皮側耳MDA 含量不斷上升，5 ℃處理先增加后下降；Cx 活性在貨架前期表現為相反的變化趨勢，1 ℃處理先增后降，5 ℃處理糙皮側耳先降后升，貨架后期，1 ℃冷藏糙皮側耳保持平穩，5 ℃處理下降。

硬度是反映糙皮側耳品質的重要指標，且受貯藏溫度的影響[18]。隨著貨架期的延長，兩處理組的糙皮側耳硬度均呈現下降趨勢。在0～1 d，1 ℃處理的糙皮側耳硬度迅速下降，后變化平穩，而5 ℃冷藏的糙皮側耳在整個貨架期間硬度下降緩慢。在貨架期0～1 d，1 ℃硬度大于5 ℃，在1～3 d，5 ℃高于1 ℃，維持較高的品質，這可能是由于低溫導致了1 ℃貯藏糙皮側耳木質素積累，硬度增加，反應在貨架期間。貨架后期，糙皮側耳失水萎蔫，子實體干枯，同時也表現為失重率的增加，這與李麗梅等[12]的結論相一致。

丙二醛（MDA）含量是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生能加劇膜的損傷，MDA含量越低，抗氧化性越強[19]。在貨架期間，5 ℃貯藏糙皮側耳的MDA含量呈現先升高后下降的變化趨勢，最終低于1 ℃，而1 ℃冷藏糙皮側耳的MDA含量始終不斷上升，表明5 ℃處理可以降低MDA含量，減緩膜的損傷。過氧化物酶（POD）作為組織老化的一種生理指標，可以催化食用菌組織內低濃度的過氧化氫（H2O2）氧化，使組織免受毒害[20]。在整個貨架期間，5 ℃處理糙皮側耳POD活性明顯高于1 ℃，表明隨著貨架期的延長，5 ℃貯藏的糙皮側耳抗氧化能力較強，而1 ℃的POD活性始終處于極低水平。早期研究表明POD作為木質素生物合成中的關鍵酶，POD活性的增加導致糙皮側耳的木質化，并表現為糙皮側耳組織硬度增加[21]，這與5 ℃貯藏糙皮側耳貨架期硬度較高的結論相一致。CAT作為一種抗氧化酶，在活性氧防御系統中扮演著重要的角色[22]，較高的CAT活性可以延緩糙皮側耳的褐變程度，保持更好的貯藏品質[23]。在貨架期間，1 ℃貯藏糙皮側耳的CAT活性逐漸下降，而5 ℃變化較平穩，在貨架期2～3 d逐漸增加并高于1 ℃處理，這表明5 ℃貯藏可以維持較穩定的CAT活性，且在貨架期后期保持較高的抗氧化能力和貯藏品質。

細胞壁是維持細胞形態的支撐物質，食用菌的成熟、軟化、衰老與細胞壁結構及成分的變化密切相關[24]。纖維素是構成食用菌細胞結構和骨架的主要成分之一，纖維素酶使纖維素降解，從而導致菇體軟化[26]。在貨架期間，5 ℃處理糙皮側耳的纖維素酶（Cx）整體上低于1 ℃，在貨架期0～2 d，1 ℃處理的糙皮側耳Cx活性顯著大于5 ℃處理，導致細胞壁結構損壞更加嚴重，反應在對糙皮側耳菌褶細胞壁的石蠟切片，5 ℃處理糙皮側耳的子實體細胞間隙較1 ℃排列有序，結構更加清晰。隨著貨架期的延長，1 ℃處理糙皮側耳細胞間隙變化更加明顯，排列更雜亂無章，這可能是由于細胞壁在細胞壁水解酶的作用下降解，使細胞壁胞間結構變得疏松，細胞之間相互分離[25]。

本試驗探究了不同貯藏溫度對糙皮側耳冷藏后貨架期品質和細胞壁變化的影響，結果表明，5 ℃貯藏后的糙皮側耳可以維持較高的硬度、POD 活性，降低Cx 活性和MDA 含量，細胞壁結構更規整、有序。而1 ℃貯藏的糙皮側耳在冷藏階段發生了木質素的積累，木質化程度更高，反應在貨架期間，導致貨架期的品質下降。因此，5 ℃貯藏糙皮側耳能更好地維持糙皮側耳冷藏后的貨架期品質。