核黃素發酵菌種改造研究進展

張兆昆,周文學,李永麗,胡建華*,劉占英

1.內蒙古工業大學化工學院, 呼和浩特 010051；2.內蒙古自治區發酵產業節能減排工程技術研究中心, 呼和浩特 010051；3.內蒙古工業大學圖書館, 呼和浩特 010051

核黃素又名維生素B2， 1879年化學家Blyth在牛奶上清液中分離出具有黃綠色的熒光物質，但這種物質不是真正意義的核黃素，他把這種物質稱為乳黃素(lactochrome)[1]。1930年Kuhn和Eggersdorfer等分離出核黃素[2-4]。黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是核黃素在機體中的常見表現形式，這兩種物質在細胞中可作為氧化還原酶的輔基參與到氧化過程中傳遞電子[5]。核黃素不能直接參與細胞代謝，但核黃素的衍生物FMN和FAD能調節機體的多種生理活動。如果動植物缺少核黃素，其生長發育會相對減慢。人體核黃素攝入過少會產生多種疾病，例如心血管病、口角炎、偏頭痛、心絞痛、白內障、瘧疾等，所以核黃素在醫學中主要作為輔助藥物參與治療[6-11]。此外，核黃素還可以作為色素、營養添加劑等應用到食品行業中。

1 核黃素生產歷史

由于人體自身不能合成核黃素，必須從外界攝取，因此核黃素的生產具有重要意義。生產方法由最初的化學合成法、化學半合成法發展到目前應用最為廣泛的微生物發酵法。1934年Kuhn和Paul通過化學合成法合成核黃素，這種生產方法是全球核黃素生產的開端，延續了將近50年。1980年，研究人員發現可以將化學合成法與微生物發酵法結合來生產核黃素，首先通過微生物發酵生成D-葡萄糖，然后使用化學合成法合成核黃素[12]。這種方法生產的核黃素雖然純度較高，但后續步驟與原來的化學合成法相同，會產生大量有毒有害物質，而且在生產時還要控制污水，對環境造成極大影響，因此化學半合成法逐漸被淘汰，目前主要通過微生物發酵法來生產核黃素。1990年，全年生產的核黃素中只有5%是通過發酵法生產的，但是到2002年全球已有75%的核黃素是通過生物發酵法生產的。與此同時，核黃素的產量也從1990年的1 600 t提升到2002年的4 000 t。到2015年核黃素產量極大提高，超過9 000 t的核黃素通過生物發酵法生產，基本上已經取代了其他合成方法[13]。

2 產核黃素的微生物種類

微生物發酵法最早開始于20世紀50年代，主要是通過能積累核黃素的菌種生產核黃素，包括棒狀桿菌[14]和棉囊阿舒氏酵母[15]。1965年多家公司希望發展核黃素微生物發酵生產線，但是因為生產工藝不成熟而無法進行[16]。隨后微生物育種和基因工程技術進入快速發展期，枯草芽孢桿菌、假絲酵母、釀酒酵母等菌種被用于核黃素生產中[17]，并且構建了各種工程菌，如表1所示，生物發酵法生產核黃素得到了廣泛關注。

目前常用于生產核黃素的工程菌有棉囊阿舒氏酵母和枯草芽孢桿菌兩種[18]，因為這兩種菌具有核黃素兩種重要的合成前體：核糖5-磷酸和鳥苷三磷酸(GTP)，核糖5-磷酸來自戊糖磷酸(PP)途徑，而鳥苷三磷酸(GTP)則來自嘌呤生物合成[19]，兩種菌株經過優化，可提高戊糖磷酸途徑和嘌呤生物合成途徑的通量[13]。

表1 核黃素主要生產菌株Table 1 The main strains of riboflavin production

棉囊阿舒氏酵母的優勢在于能夠天然積累核黃素，枯黃芽孢桿菌的優點是生長期短，產能高。我國湖北廣濟藥業股份有限公司利用枯草芽孢桿菌生產核黃素產率可達26.5 g·L-1[20]。但是，通過微生物法生產核黃素也存在一些不足，主要有以下兩方面：第一，下游分離和提純技術比較滯后，使得核黃素純度不高；第二，目前越來越多的工業菌株是通過基因工程技術構建的，生產過程中經常添加抗生素，容易出現抗生素濫用或者攜帶未知突變基因，尤其是當后期滅菌工藝處理不當時，對環境及人類健康會造成一定的影響。2015年，歐盟海關在由中國出口至歐洲的食品級核黃素中分離得到1株未被授權的重組枯草芽孢桿菌DNA，導致產品全部被退回[21]。2018年，FEEDAP專家組認為使用枯草桿菌菌株KKCM-10445生產的核黃素(80%)存在遺傳修飾菌株攜帶編碼抗菌藥物耐藥性基因的活細胞和DNA擴散的風險，對目標物種、消費者、使用者和環境構成了風險，導致廣濟藥業核黃素出口歐盟受阻[22]，這也給使用基因重組微生物的生產提出警示。

3 枯草芽孢桿菌合成核黃素的代謝途徑

在細菌中，核黃素的生物合成是通過一系列酶促步驟進行的。枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，被認為是“安全菌種”，經常被當作“平臺菌種”[21]。目前我們對枯草芽孢桿菌核黃素合成代謝途徑認識比較清晰，枯草芽孢桿菌從吸收葡萄糖開始合成核黃素，經過戊糖磷酸途徑和嘌呤合成途徑生成的核酮糖-5-磷酸(Ru-5-P)和鳥苷三磷酸(GTP)，在核黃素操縱子所編碼的相關功能酶的催化作用下合成核黃素，合成途徑如圖1所示。

枯草芽孢桿菌不能天然積累核黃素，是在ribC基因編碼的核黃素酶和FAD合成酶的催化下形成核黃素的下游產物FMN和FAD。Bresler等[24]利用ribC的突變基因讓枯草芽孢桿菌積累核黃素，推測得出以下結論：第一，突變基因能減少核黃素激酶和FAD的活性，降低FMN和FAD的產量，在枯草芽孢桿菌內積累核黃素；第二，FMN和FAD含量降低之后，它們對核黃素的負反饋降低，核黃素大量增加。

1—6-磷酸葡萄糖脫氫酶；2—6-磷酸葡萄糖內酯酶；3—6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；4—磷酸核糖焦磷酸合成酶；5、6—相關酶促反應；7：GTP環水解酶Ⅱ；8—脫氨酶；9—還原酶；10—未知磷酸酶；11—3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶；12—二氧四氫喋啶合成酶；13—核黃素合成酶；Glucose—葡萄糖；Glucose-6-P—6-磷酸葡萄糖；Glucose-6-P-lactone—6-磷酸-葡萄糖酸內酯；6-P-gluconate—6-磷酸-葡萄糖酸；Ru-5-P—5-磷酸核酮糖；Ribo-5P—5-磷酸核糖； PRPP—5-核糖磷酸焦磷酸；IMP—次黃嘌呤核苷單磷酸；GTP—鳥苷三磷酸；DARPP—2，5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5-磷酸；ARPP—5-氨基-6-核糖氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5-磷酸；ArPP—5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5-磷酸；ArP—5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮；DHBP—3，4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸；DEL—6，7-二甲基-8-核糖醇基-2，4-二氧四氫喋啶。圖1 枯草芽孢桿菌核黃素合成圖[23]Fig.1 The riboflavin biosynthesis pathway of B. subtilis[23]

4 菌種選育方法

4.1 誘變育種

誘變篩選是目前最常用的產核黃素菌種提高產量的選育方式，主要分為物理誘變和化學誘變。物理誘變通常是指采用各種高能射線穿透或者破壞遺傳物質引起基因位點突變，從而篩選出需要的菌株性狀。魏士平等[25]利用紫外誘變對棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)3#進行誘變, 得到 331#突變株，極大提高了核黃素合成速率，優化后核黃素產量為5 512 μg·mL-1。2020年，祝金山等[26]以枯草芽孢桿菌QJVB-1為出發菌株,采用常壓室溫等離子體誘變技術,得到1株核黃素產量高、遺傳性狀穩定的突變株QJVB-2-91。突變株核黃素最高產量達到9.447 g·L-1，較出發菌株提高16.8%，發酵周期縮短6 h。化學誘變在核黃素的菌種選育過程中較少看到文獻報道，但是往往把經過誘變的菌種用嘌呤或類嘌呤物質誘導，篩選出體內含有嘌呤合成和核黃素合成的工程菌。這種菌自身具有核黃素表達的基因，因此核黃素產量較高。Lee等[20]使用這種方法，將蘇氨酸和脯氨酸的結構類似物作為生產工程菌的篩選條件，獲得工程菌B.subtilisAS5，核黃素合成能力顯著提高，可以在70 h生產26 g·L-1的核黃素。2019年，郭佳欣等[27]以BS120作為出發菌株，通過常壓室溫等離子體誘變處理，以8-氮鳥嘌呤為篩選拮抗物進行篩選，得到菌株BSG1，核黃素產量比出發菌株提高61.60%。

4.2 基因重組育種

基因重組是利用原生質體融合等方式將親本中的基因重排得到良好的性狀整合，然后篩選得到目的菌株[28]。和以往菌株進化策略相比，這種方式的目的性更強，更容易得到目的菌種。因為菌株自身帶有有利突變，所以能在一定程度上減少不利突變的產生幾率，克服傳統育種周期長、隨機性強、效果差等缺陷，所以基因重組育種不論是在現在還是未來都是一個很好的研究方向。對于產核黃素的菌種基因工程改造主要針對提高核黃素操縱子過表達和提高Ru5P和GTP兩種前體供應量合成途徑通量兩個方向以外，還有一些新的手段被用于產核黃素菌種的育種過程。

4.2.1提高核黃素操縱子表達 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子長約4.3 kb，共包含5個基因，這些基因與核黃素合成途徑緊密相關，這些操縱子上的基因所控制和表達的酶共同催化促進核黃素的形成與積累，相關基因所表達的酶如表2所示。

表2 枯草芽孢桿菌中與核黃素合成相關調控基因[29]Table 2 Regulatory genes of riboflavin synthesis in B. subtilis[29]

ribT基因功能尚無相關報道，但Perkins等[17]發現缺失ribT的突變株合成核黃素的能力會有所減弱，由此可推測ribT與核黃素的合成有關。

核黃素操縱子內部基因受一個一級啟動子P1(ribG上游)和兩個二級啟動子P2(ribE編碼區內)和P3(ribT上游)控制，P1與P2由σA因子識別，且受細胞內核黃素負反饋抑制，核黃素濃度過高會削弱啟動子表達強度[30]。 Li等[31]通過把枯草芽孢桿菌的操縱子P1替換為組成型強啟動子P43，過量表達核黃素合成基因，并解除細胞內核黃素水平對基因的負反饋抑制作用，從而極大地提高了核黃素產量。Duan等[32]將含有蠟樣芽孢桿菌(B.cereusATCC 14579)核黃素操縱子的片段整合至B.subtilisRH33基因組得到工程菌株B.subtilisPY，過表達核黃素操縱子，核黃素產量達到4.3 g·L-1。2014年，Shi等[33]將枯草芽孢桿菌168的強組成型啟動子P43插入菌株BS77ribA的上游，以產生突變株BS89，突變型BS89中ribA的過表達導致核黃素產量提高了約1.4倍，同時比核黃素的特定生產速率顯著提高。

隨著CRISPR/Cas9n的多重基因組編輯系統的開發和應用，多重基因組編輯技術得到了飛速發展,其優勢在于可直接在基因組上對DNA序列進行定點突變、插入、敲除、組合編輯等，并且在多個物種中已經實現多重基因編輯；利用CRISPR/Cas9n的多重基因組編輯系統構建核黃素高產菌株具有廣闊的發展前景，也為構建更安全、更高效的工業生產菌株提供了方向。2019年，劉定宇等[34]利用CRISPR/Cas9n的多重基因組編輯系統對枯草芽孢桿菌核黃素操縱子中的3個基因(ribB、ribA和ribH)進行了微調,將質粒pBSCas9n-gRNArib和pDonor-ribRBSLib(來自質粒庫)導入刪除ligD基因的BS89中以啟動同源重組，并取代ribB、ribA和ribH的天然RBS區域，發酵驗證后依據核黃素產量選擇具有3個調節基因的11個菌株以及具有2個調節基因的3個菌株。與BS89相比，最佳菌株CY46產生了1.39 g·L-1的核黃素，數據證明在單個周期內核黃素的產量顯著提高，也表明操縱子的優化表達取決于各種基因的平衡表達，而不是單調地過表達每個基因。

4.2.2提高Ru5P和GTP兩種前體供應量合成途徑通量 除了增加核黃素合成途徑相關基因的過表達外，提高Ru5P和GTP兩種前體供應量合成途徑通量，同樣是提高核黃素產量的有效策略。以枯草芽孢桿菌合成核黃素途徑為例，增加核黃素產量主要有提高嘌呤生物合成途徑和戊糖磷酸兩個途徑。

從戊糖磷酸途徑的核糖-5-磷酸開始，在多種酶的催化反應下，生成一系列嘌呤代謝物的過程稱為嘌呤生物合成。這些嘌呤代謝物包括IMP、AMP、ADP、ATP、GMP、GDP和GTP等。在枯草芽孢桿菌中，嘌呤操縱子是這一生物合成途徑的關鍵，主要包含12個編碼基因的基因簇，編碼酶如表3所示，除表格所列之外，還有purA、guaA、purB、guaB和guaC等一系列基因。

表3 嘌呤操縱子編碼基因及表達酶Table 3 The code gene and expression enzyme of purine operon

枯草芽孢桿菌的嘌呤合成途徑受到細胞內多種機制調控，主要包括鳥嘌呤介導的前導mRNA轉錄衰減機制、腺嘌呤介導的轉錄起始阻遏機制和酶水平的負反饋抑制機制,通過對嘌呤生物合成途徑的改造，來抑制或消除這種嚴格的調控機制，從而提高核黃素的產量。2014年，Shi等[33]對嘌呤生物合成途徑進行了代謝工程改造，敲除了PurR阻遏蛋白、嘌呤操縱子5′-UTR的鳥嘌呤核糖開關，定量RT-PCR分析顯示嘌呤基因的相對轉錄水平上調了約380倍，使得核黃素產量極大提高。

戊糖磷酸途徑作為糖酵解途徑和嘌吟合成途徑的關鍵中間代謝途徑，其中間代謝物Ru5P和R5P分別是核黃素和嘌呤合成的前體物之一。由此可知，在枯草芽孢桿菌中，戊糖磷酸途徑對核黃素的合成具有決定作用[35]。Duan等[36]通過在宿主菌B.subtilisPY中過表達zwf(6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因)，使戊糖磷酸途徑通量增加，從而使胞內Ru5P濃度提高了4倍，最終核黃素的產量提高近25%。2015年，程毅鵬等[23]運用自主構建的新型抗性質粒在宿主菌內過量表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶得到重組菌B.subtilisRF1/pMA5-sat-zwf，重組菌胞內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力比原始菌提高了近50倍，發酵60 h核黃素產量達到13.5 g·L-1，相比原始菌核黃素產量提高了32.3%。

4.2.3其他基因重組育種方法 除上述兩種主要途徑以外，近些年還有研究者從不同的角度出發，進行了其他基因育種方法的研究。2016年，徐志博等[37]利用PCR技術從Bacillussubtilis168中擴增出3.5 kb的核黃素操縱子,將其分別連接到不同拷貝數的表達載體pSC101、p15A、pBR322，得到重組載體pSC101-BSrib、p15A-BSrib和pBR322-BSrib，并分別轉化到大腸桿菌(E.coliK-12 MG1655)，搖瓶發酵結果表明：其核黃素合成能力隨著質粒拷貝數的增加而增強。最后，通過無痕基因操作技術，減弱工程菌株ECX3ribF基因的表達以減少核黃素轉化為FMN和FAD，搖瓶發酵表明ECX4的核黃素產量提高到292.3 mg·L-1。黃燦等[38]以B.subtilis120 spc為出發菌株，在染色體上表達糞堆梭菌的xyn10B基因和月形單胞菌GA192的xsa基因，并過表達大腸桿菌的糖異構酶基因xylA、木酮糖激酶基因xylB、B.subtilis內源木糖運輸蛋白表達基因araE，得到以木聚糖為碳源生產核黃素的菌株E2X6PAB，發酵結果表明核黃素產量為(2 484.303±25.9) mg·L-1，核黃素得率約為(49.67±0.5) mg·g-1葡萄糖，并由此證實了利用木聚糖生產核黃素的可行性。2019年，Wang等[39]將Geobacillus和Parageobacillus的熱休克蛋白(HSP)基因導入產生核黃素的B.subtilis446菌株中，在強大的組成型啟動子P43的控制下，B.subtilis446中異源表達了12種HSP基因及其2種組合(PtdnaK-PtdnaJ-PtgrpE和PtgroeL-PtgroeS)。其中菌株B.s446-HSP20-3，B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在44～48 ℃時其細胞密度增加了25%以上，在39和43 ℃的較高溫度下發酵顯示核黃素效價提高了23%～66%，發酵時間縮短24 h。由此可知，將嗜熱菌中的HSP植入B.subtilis446不僅提高了其耐熱性，也提高了核黃素生成速率。

5 展望

通過分析前人對核黃素的研究可知，核黃素是一種和生物生長密切相關的物質，可作為輔助藥物、添加劑等在治療和生產中使用。核黃素的生產從過去的化學合成法與化學半合成法逐漸被微生物發酵法所取代，微生物發酵法符合社會發展的趨勢，相對于傳統方法不僅能提高產量、降低成本，還能保護環境、防止污染。發酵法雖然使得核黃素產量極大提高，但依然無法滿足市場上對核黃素的需求缺口，因此生產菌種、發酵工藝及分離純化技術仍在不斷的改進。其中發酵菌種的改造一直是關注的重點，通過傳統的化學及物理誘變方式，取得產量的大幅提高，而隨著如重離子輻照誘變、常壓室溫等離子體(ARTP)、合成生物學等新型誘變育種方法的出現，為工業生產提供了更多高產能力的菌種，且利用多重基因組編輯技術構建的工業菌也將會成為研究熱點，未來我們仍需不斷探尋新的育種方法，進一步提高核黃素產量，滿足市場需求。