FAM96A和FAM96B結構與功能的研究進展

張迪迪,顧宇軒,孫霄麟,張麗娜

北京工業大學環境與生命學部生命科學與化學學院, 北京 100124

惡性腫瘤，即癌癥，已發展成為世界范圍內備受關注的疾病。而腫瘤的形成和轉移是一個由多因素、多基因、多步驟和多階段共同作用的結果，涉及到癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引發的多種細胞生物學行為的改變[1-2]。96序列相似的家庭成員A(family with sequence similarity 96 member A，FAM96A)和96序列相似的家庭成員B(family with sequence similarity 96 member B，FAM96B)最初是運用比較基因組的方法從人類表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)數據庫中通過比對人與線蟲的基因組而發現的一類基因[3]。研究表明，FAM96A和FAM96B是屬于MIP18(MMS19-interacting protein of 18 kD)家族的2個高度保守的同源蛋白。MIP18可以與具有DNA損傷修復作用的甲基磺酸敏感性基因19(methyl methanesulfonate sensitivity gene 19，MMS19)和胞質鐵硫組裝蛋白組分1(cytosolic iron-sulfur assembly component 1，CIAO1)組成一個復合物，與胞質鐵硫簇組裝相關[4]。目前國內外關于FAM96A和FAM96B功能的研究報道相對較少，其中一些報道發現，FAM96A和FAM96B在多種腫瘤組織中的表達水平下降，提示其可能是作為抑癌基因參與腫瘤的發生發展[5-8]。但目前對于FAM96A和FAM96B具體的抑癌作用機制尚不明確。因此，系統揭示FAM96A和FAM96B在腫瘤發生發展中的功能差異和分子機制具有重要的意義。

除與腫瘤發生發展相關外，近年來國內外一些研究團隊已經鑒定出多種與FAM96A和FAM96B相互作用的不同蛋白質，揭示FAM96A和FAM96B在體內發揮著多種不同功能。除FAM96A和FAM96B都可以與CIAO1結合，參與胞質鐵硫蛋白組裝過程外[9]，FAM96A同凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1，Apaf1)相互作用增強線粒體凋亡的誘導作用[5]，而FAM96B與凋亡素(apoptin)相互作用參與細胞凋亡調控[10]。這說明FAM96A和FAM96B主要是通過與其他蛋白質相互作用在體內發揮功能。因此，篩選和鑒定與FAM96A和FAM96B相互作用的其他蛋白質，有助于揭示二者在體內更多的新功能。基于此，本文就目前國內外關于FAM96A和FAM96B的結構與功能所取得的研究進展予以綜述，并對其未來的研究前景進行展望，從而為進一步明確FAM96A和FAM96B的功能和機制提供基礎。

1 FAM96A和FAM96B的結構

FAM96A亦稱為CIA2A或CIAO2A，定位于染色體15q22.31；FAM96B亦稱為CIA2B、CIAO2B、MIP18或CGI-128，定位于染色體16q22.1-22.3。FAM96A包含160個氨基酸，FAM96B包含163個氨基酸，二者的相對分子質量大小約為18 kD，序列同源性高達50%，都含有DUF59(domain of unknown function 59)結構域[11]。FAM96A和FAM96B一級結構(圖1)的區別在于：FAM96A的N端有一小段預測的27個氨基酸的信號肽序列(1～27)，28～160位氨基酸是DUF59結構域；FAM96B的N端則沒有信號肽，DUF59結構域位于43～121位氨基酸[12]。

圖1 FAM96A和FAM96B的一級結構特征示意圖Fig.1 Schematic diagram of primary structure features of FAM96A and FAM96B

人單體FAM96A(28～160 AA)的DUF59結構域的溶液結構已經通過核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)手段解析得到(PDB ID：2M5H)[12]。有趣的是，FAM96A的DUF59結構域在溶液中存在單體和二聚體兩種形式，而且在結晶過程中FAM96A的單體可以轉化成不同的結構域交換(domain-swapped)二聚體，這種蛋白質的結構域交換會導致其在體內具有更多的生物學功能。通過X射線衍射手段解析FAM96A的DUF59結構域127個氨基酸的1.8 ?晶體結構發現，FAM96A存在2種結構域交換的二聚體結構形式，分別稱為major dimer和minor dimer結構形式[13]。來自于PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)FAM96A的major dimer(PDB ID：3UX2)和minor dimer(PDB ID：3UX3)2種不同的二聚體的晶體結構如圖2所示。Major dimer的每個亞基是一種包含5個α螺旋和2個β鏈的開放構象，結構域交換的部分位于多肽鏈的中間，這種結構形式是比較穩定的；而minor dimer這種結構形式的穩定還需要結合Zn2+離子。通過比較這2種結構形式，發現除2個鉸鏈環外，它們具有相同的二級結構排列。2個鉸鏈環控制著FAM96A的結構域交換，而且它們是高度靈活且保守的。具體來講，第1個鉸鏈環在major dimer延伸，在minor dimer形成一個緊密的轉彎；第2個鉸鏈環位于交換結構域的C端區域(122～127 AA)，在major dimer中是無序的且高度靈活的[11,13]。序列比對分析結果表明，真核生物的DUF59區域序列高度保守，原核生物的此區域并不保守，而且目前已經有3個細菌DUF59蛋白的結構被解析得到[14]，但是它們只有單體結構形式，沒有結構域交換的二聚體形式出現。這暗示結構域交換可能是真核生物而非細菌DUF59結構域的一個共同特征。

圖2 PDB數據庫中的FAM96A的2種domain-swapped二聚體晶體結構圖Fig.2 Crystal structure of two kinds of domain-swapped dimers of FAM96A from PDB database

人FAM96B的DUF59結構域的晶體結構尚未被單獨解析報道，但是FAM96B可以和CIAO1相互作用，目前PDB數據庫已經收錄了利用X射線晶體衍射解析的小鼠和黑腹果蠅的MMS19-CIAO1-FAM96B CIA靶向復合體(PDB ID：6TC0)以及黑腹果蠅的CIAO1-FAM96B CIA核心復合體(PDB ID：6TBN)的晶體結構。

雖然含有DUF59結構域的蛋白質在原核生物和真核生物中均已經被發現，但是據預測哺乳動物體內含有DUF59結構域的蛋白質只有FAM96A和FAM96B[13]。還有一些研究表明DUF59結構域對于結合金屬離子發揮著特定的作用。例如，在需氧菌中，2個含DUF59結構域的蛋白質PaaD和PaaJ是苯乙酰輔酶A加氧酶復合物的金屬離子結合亞基[15]；來自于極端嗜熱菌海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的DUF59蛋白TM0487結構中包含1個保守的二價金屬離子結合活性位點，暗示著細菌DUF59蛋白可能在結合鐵硫簇中發揮作用[14]；此外，在模式植物擬南芥中的研究發現含DUF59結構域的蛋白HCF101和AE7很可能是負責鐵硫簇的組裝[16-17]；最近還有研究表明含有DUF59結構域的蛋白質與鐵硫蛋白成熟和細胞內鐵穩態相關[18]。

2 FAM96A和FAM96B在腫瘤發生發展中的作用

近年來，國內外一些研究發現FAM96A和FAM96B在人胃腸道間質瘤、結腸癌、肝癌、胃癌和乳腺癌組織中的表達量顯著降低，提示二者可能是潛在的抑癌基因參與腫瘤的發生發展過程。

2015年，國外一項研究報道發現FAM96A在人胃腸道間質瘤中表達量降低，而在胃腸道間質瘤細胞中過表達FAM96A會增加間質瘤細胞的凋亡敏感性，降低致瘤性。進一步研究顯示，FAM96A可以通過結合Apaf1誘導細胞發生線粒體凋亡[5]。Apaf1可以結合線粒體釋放的細胞色素c，再結合Caspase-9從而激活Caspase-3，誘發細胞凋亡的級聯反應[19]。FAM96A可以結合Apaf1，被認為是人胃腸道間質瘤的一個新的促凋亡腫瘤抑制因子[5]。國內最新的一項研究也證實FAM96A和FAM96B在胃腸道間質瘤組織中呈低表達，FAM96A和FAM96B很可能是新的抑癌基因，其表達的減少甚至缺失可能抑制了胃腸道間質腫瘤細胞的凋亡[20]。隨后，Zhang等[21]構建了人端粒酶逆轉錄酶受體(human telomerase reverse transcriptase receptor，hTERTR)和FAM96A的融合蛋白，發現hTERTR-FAM96A融合蛋白可以分別與hTERT和Apaf1特異性結合，而且能誘導肝癌細胞凋亡，并進一步提高肝癌細胞凋亡敏感性，同時抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。此外，hTERT-FAM96A聯用還可以促進毒性T淋巴細胞反應、γ-干擾素釋放和T淋巴細胞炎性浸潤，從而增強對肝癌細胞的毒性作用。因此，hTERTR-FAM96A融合蛋白可能是一種有效的抗腫瘤抑制劑[22]。

此外，國內不少研究還發現FAM96A和FAM96B在人類多種腫瘤組織(包括胃腸道間質瘤、肝癌、胃癌、結腸癌和乳腺癌組織)中表達顯著下降，具體情況如表1所示。這些研究已經初步證實在相應的腫瘤細胞中過表達FAM96A或FAM96B會抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，其表達水平可能與腫瘤的發生發展和侵襲轉移密切相關[6-7,23]。目前關于FAM96B在腫瘤發生發展過程中的功能尚無系統性的完整報道，僅知道其在腫瘤組織中呈現低表達，而在結腸癌細胞HCT116[8]、胃癌細胞SGC7901[7]和肝癌細胞HepG2[23]中過表達FAM96B能夠抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，但對于其具體的分子調控機制尚不明確。

表1 FAM96A和FAM96B在不同類型腫瘤組織中的表達Table 1 Expression of FAM96A and FAM96B in different types of tumor tissues

這些研究結果基本已經證實FAM96A和FAM96B與腫瘤發生發展的進程密切相關，可以作為潛在的抑癌基因發揮抑制腫瘤生長的作用，二者很可能成為臨床上惡性腫瘤新的診斷標志物和治療靶點。但目前關于FAM96A和FAM96B在腫瘤組織中呈現低表達的原因以及抑制腫瘤生長轉移的分子機制并不清楚，因此，深入系統地研究FAM96A和FAM96B在腫瘤發生發展中的分子調控機理具有非常重要的意義。

3 FAM96A和FAM96B與其他蛋白質相互作用發揮功能

除了與腫瘤的發生發展密切相關，FAM96A和FAM96B在體內還具有多種重要的生理功能。目前大多數研究表明FAM96A和FAM96B在體內發揮不同的功能主要是依賴于與其他蛋白質之間的相互作用。

3.1 FAM96A和FAM96B參與胞質鐵硫簇組裝

CIAO1可以參與胞質和核鐵硫蛋白的組裝[32-33]。早期酵母雙雜交實驗分析表明FAM96A和FAM96B都能同CIAO1發生相互作用[34]。隨后通過免疫共沉淀實驗證明FAM96A和CIAO1在體內也存在相互作用，而且FAM96A主要定位于細胞質中[13]。進一步研究證實FAM96B也可以同CIAO1在體內發生相互作用，FAM96A、FAM96B和CIAO1都是胞質鐵硫蛋白組裝器(cytosolic Fe/S protein assembly machinery，CIA)的組分，CIAO1與FAM96A或FAM96B以及CIA靶向因子MMS19相互作用組成2種大的蛋白復合物。其中，FAM96B-CIAO1-MMS19復合物可以促進大多數胞質-核鐵硫蛋白的組裝，而FAM96A-CIAO1-MMS19蛋白復合物特異性促進鐵調節蛋白1(iron regulatory proteins 1，IRP1)成熟和IRP2穩定化，從而維持細胞內鐵穩態[9,35-36]。FAM96B不僅與CIAO1和MMS19相互作用形成復合物，還能進一步同ADP/ATP轉運酶2(ADP/ATP carrier protein，ANT2)相互作用形成復合體參與胞質鐵硫簇蛋白的組裝[4]。此外，FAM96B還是有絲分裂紡錘體相關的MMXD(MMS19-MIP18-XPD)復合體的組分，MMXD復合體的功能是負責DNA的損傷修復和染色體的正確分離[37]。在人結腸癌HCT116細胞中敲低FAM96B、MMS19或XPD則導致有絲分裂中紡錘體的錯誤定位和異型細胞核堆積，這也說明FAM96B是定位于紡錘體中，在有絲分裂染色體的正常分離過程中發揮重要作用[37]。由此可見，FAM96A和FAM96B可與一些相同的蛋白質(如CIAO1和MMS19)相互作用形成不同的復合體而表現出不同的功能，這可能跟二者不同的亞細胞定位有關。

3.2 FAM96A和FAM96B參與腫瘤細胞凋亡調控

研究發現FAM96A和FAM96B是通過與不同的蛋白質相互作用特異性誘導腫瘤細胞凋亡。其中，FAM96A是與Apaf1相互作用，通過線粒體凋亡途徑在胃腸道間質瘤細胞中發揮促凋亡功能[5]。在胃腸道間質瘤細胞中過表達FAM96A，可增強胃腸道間質瘤細胞對凋亡的敏感性，而且在體內抑制腫瘤的生長，而沉默FAM96A的表達導致胃腸道間質瘤發生[5]。早期通過酵母雙雜交系統發現Apoptin(凋亡素)相互作用的蛋白FAM96B，經免疫共沉淀實驗證明FAM96B在正常細胞和腫瘤細胞中都與Apoptin存在相互作用[10]。Apoptin是來源于雞貧血病毒的一種小分子蛋白，由121個氨基酸組成，分子量為13.6 kD，通過不依賴于p53介導的途徑特異性誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無毒副作用。Apoptin蛋白的核定位與其誘導凋亡的活性密切相關，研究發現在腫瘤細胞中過表達的FAM96B通過與Apoptin的相互作用可導致部分Apoptin滯留于細胞質中，從而顯著抑制Apoptin誘導的腫瘤細胞凋亡效應，這可能與FAM96B導致Apoptin的核定位改變有關[38-39]。由此可見，FAM96A和FAM96B在腫瘤細胞凋亡調控方面存在比較大的差異，二者是通過與不同的凋亡相關蛋白相互作用而參與腫瘤細胞凋亡調控。

3.3 FAM96A和FAM96B參與的其他功能

3.3.1FAM96A參與炎癥調控 早期研究發現，FAM96A mRNA在人和小鼠的巨噬細胞中高度富集，在B和T淋巴細胞中其表達水平明顯升高，提示FAM96A可能是一個重要的炎癥調節因子和抗炎藥物設計靶點[13]。FAM96A與hTERT聯用可以通過上調毒性T淋巴細胞反應、γ-干擾素釋放和T淋巴細胞炎性浸潤，從而增強對肝癌細胞的毒性作用[21]。最新一項在小鼠結腸炎模型中的研究發現，FAM96A-/-基因敲除小鼠對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導的結腸炎的易感性明顯增加，FAM96A可以通過預防腸道微生物失調來維持結腸內環境的穩態[40]。該項研究提供了關于宿主-微生物群相互作用的新證據，也進一步表明FAM96A在體內炎癥調控中也發揮重要的作用。

3.3.2FAM96B在細胞增殖與遷移中的作用 目前還有一些研究報道了FAM96B的其他功能，也是跟其相互作用的蛋白質密切相關。Yang等[41]發現FAM96B與血管內皮細胞的增殖與遷移相關。FAM96B是堿性螺旋-環-螺旋蛋白(E2-2)的調節基因，FAM96B通過與E2-2蛋白相互作用發揮功能。由于E2-2負向調控血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的啟動子活性，在血管內皮細胞中過表達FAM96B可下調E2-2蛋白的表達，從而促進血管內皮細胞增殖、遷移及微管形成。

3.3.3FAM96B在細胞衰老中的作用 FAM96B還與細胞衰老有關。Xiong等[42]采用酵母雙雜交和免疫共沉淀實驗技術證實FAM96B通過與A型核纖層蛋白前體(prelamin A)相互作用參與細胞衰老調控。Prelamin A的加工過程與衰老密切相關，是一種新的血管衰老的生物標志物[43]。這個過程可能是通過prelamin A相互作用蛋白FAM96B實現的，prelamin A與FAM96B在細胞內外均有相互作用，prelamin A通過相互作用將定位于胞質中的FAM96B招募至核周，并共定位于細胞核膜，導致基因組不穩定，促進細胞衰老。

最新研究發現FAM96B能抑制牙髓干細胞的衰老。在牙髓干細胞中沉默FAM96B基因導致TERT活性下降，衰老相關的SA-β-gal陽性細胞數量及p16和p53蛋白表達量明顯增加；過表達FAM96B則導致堿性磷酸酶活性顯著升高，牙髓干細胞的礦化能力增強[44]。

3.3.4FAM96B與SelW蛋白相互作用 此外，FAM96B還被報道是腦硒蛋白W(selenoprotein W，SelW)的一個新的相互作用蛋白。Chen等[45]采用酵母雙雜交和免疫共沉淀以及熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)實驗證實FAM96B與SelW在體內存在直接的相互作用。SelW蛋白在大腦發育中起著關鍵作用，SelW蛋白與FAM96B之間的這種直接相互作用可能為SelW蛋白在腦發育和神經退行性疾病中的作用提供新的見解。研究發現沉默SelW的小鼠胚胎神經細胞對DNA損傷表現的更為敏感[46]；SelW還被證實參與調控細胞周期蛋白激酶，通過激活細胞分裂周期25同源物B(cell division cycle 25 homolog B，CDC25B)逆轉DNA損傷導致的G2期阻滯[47]。由于FAM96B在DNA損傷修復中也發揮著作用，SelW與FAM96B之間的相互作用可能阻斷SelW的作用，導致細胞周期阻滯，從而啟動DNA損傷修復，確保基因組的穩定性。

4 展望

綜上所述，FAM96A和FAM96B不僅作為潛在的抑癌基因抑制腫瘤的發生發展，而且能通過與其他不同的蛋白質相互作用在體內發揮不同的功能。雖然目前針對FAM96A和FAM96B功能的研究取得了一定的進展，但是仍然有許多亟待解決的問題，如FAM96A和FAM96B在腫瘤組織中的表達降低的原因和分子機制，沉默FAM96A和FAM96B對腫瘤細胞的生物學功能的影響。因此，在未來的工作中通過系統研究并揭示FAM96A和FAM96B在腫瘤組織中低表達的原因及其在腫瘤發生發展中具體的分子調控機制，有望為惡性腫瘤的臨床診斷和治療提供新靶點和新思路。此外，通過酵母雙雜交和免疫共沉淀等實驗技術篩選和鑒定更多與FAM96A和FAM96B相互作用的蛋白質也是頗具研究前景的一個方向，有望揭示FAM96A和FAM96B在體內參與的更多新的功能。