新型基因編輯技術(shù)在單細胞微藻中的應用進展

曹豪豪,張紅兵*,薛溪發(fā),李左群,閆洪波,李會宣

1.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院, 石家莊 050061;2.河北德諾商品檢測技術(shù)服務有限公司, 石家莊 050061

當前化石能源短缺及其應用帶來的污染日趨嚴重，阻礙了世界經(jīng)濟發(fā)展，研發(fā)替代能源勢在必行，生物燃料作為可再生的能源形式潛力巨大，成為研究焦點[1]。微藻是自然界中起源最早、數(shù)量最多、分布最廣的生物種類，是含有葉綠素a的光合作用微生物。由于許多種屬的微藻在生長過程中能在細胞內(nèi)大量積累生物質(zhì)，已用于生產(chǎn)沼氣、乙醇、生物柴油、生物氫等環(huán)保、清潔、經(jīng)濟的生物燃料，是化石燃料的理想替代品，同時利用藻類生物質(zhì)生產(chǎn)食品和飼料添加劑乃至藥物等也引起了廣泛關注[2]。

為了充分發(fā)揮微藻生產(chǎn)潛力、優(yōu)化生產(chǎn)工藝，有必要利用分子生物學技術(shù)研究微藻的遺傳背景，解決脂質(zhì)積累率偏低[3]、固定二氧化碳效率差[4]、培養(yǎng)周期長[5]等瓶頸問題。由于生物信息學和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是新型基因編輯技術(shù)，已經(jīng)成為解決上述問題的重要策略。其中，應用最廣泛的是TALEN和CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)，在哺乳動物、植物等中已取得了較好的效果[6]。基于此，本文就上述技術(shù)在微藻遺傳改造方面的應用進行綜述，以期為相關研究提供借鑒。

1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)的核心是通過對生物體特定DNA片段的插入、敲除、修飾或替換等手段，使預期基因組序列發(fā)生改變并遺傳，進而實現(xiàn)目標基因的編輯[7]。該方法不僅可以研究目的基因的功能，還可以賦予生物體新的生物學特性。特別是近幾年被稱為分子剪刀的工程核酸酶,極大地促進了基因組編輯的發(fā)展，包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas(CRISPR-associated systems)核酸酶系統(tǒng)。

1.1 ZFN技術(shù)

目前應用的ZFN是一類人工合成的核酸內(nèi)切酶，也就是具有特定基因編輯功能的蛋白質(zhì)，由3個人工設計的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域組成，能特異剪切基因組某段DNA[8]。

ZFN的N末端是DNA的結(jié)合域，一般含3～4個串聯(lián)的CysHis2鋅指蛋白，其中每個鋅指蛋白能夠結(jié)合特定靶DNA序列中3 bp的片段；C末端多為非特異性FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域，具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠切割非特異DNA，切割時FokⅠ的催化結(jié)構(gòu)域需要以適當?shù)膲A基距離形成異二聚體。如圖1所示，為了進行有效的二聚化和切割，2個ZFN分子以尾對尾方式與相對鏈上的靶DNA結(jié)合，相間隔5～7 bp，在此間隔區(qū)中可以實現(xiàn)特定DNA位點的切割[10]。

1.2 TALEN技術(shù)

TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自轉(zhuǎn)錄激活子樣效應物(transcription activator-like effector，TALE)，該效應物是源于植物病原菌黃單胞菌屬(Xanthomonas)[11]。

與ZFN相似，TALEN也包含2個結(jié)構(gòu)域：N端為DNA特異性識別和結(jié)合區(qū)域TALE，C端為與ZFN相同的FokⅠ核酸酶催化結(jié)構(gòu)域。其中TALE由N端轉(zhuǎn)錄信號、C端核定位信號、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以及DNA特異性識別和結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。在TALE蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中含有由34個氨基酸組成的鋅指模塊同源重復序列，其中第12、13位為重復可變的雙氨基酸殘基(repeat variant diresidues，RVD)。TALE所識別的堿基是由不同的RVD所決定的，其中NI識別A、NG識別T、NH識別G、NN識別A或G、HD識別C、NS對4種堿基都可以識別，因此經(jīng)過人工編輯TALE的RVD，能夠識別對應的DNA序列。FokⅠ結(jié)構(gòu)域來自FokⅠ核酸酶的末端活性域，需要二聚化才有活性。所以，在基因編輯的過程中需要2個TALEN蛋白，如圖2所示，目標序列的上游與下游由2個TALE結(jié)構(gòu)域分別識別，2個FokⅠ結(jié)構(gòu)域作用在一段DNA上造成雙鏈斷裂，可以在該位點進行插入、敲除或點突變等操作[13-15]。

1.3 CRISPR/Cas技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[16-18]。CRISPR即成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列，而 Cas 即 CRISPR 相關系統(tǒng)，位于 CRISPR序列的上游，包含多種功能蛋白基因[19]。

CRISPR是其中的靶位點識別組件，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成CRISPR-RNA前體(pre-crRNA)，隨后前體被加工成短的成熟的CRISPR-RNA(crRNA)，crRNA將與靶基因DNA通過堿基互補配對進行識別。切割DNA的組件為Cas核酸內(nèi)切酶，CRISPR與Cas結(jié)合形成一種RNA-蛋白質(zhì)的復合體，RNA特異性識別結(jié)合DNA，并引導Cas核酸酶特異性切割DNA[20]。

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)可分為TypeⅠ型、TypeⅡ型和Type Ⅲ型3種類型。其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)CRISPR/Cas9是目前研究最為充分的系統(tǒng)，如圖3所示，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，向?qū)NA(guide RNA，gRNA)代替了上述crRNA和tracrRNA兩者的作用，在gRNA的作用下，識別靶序列的原型間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)位點并引導Cas9核酸酶切割靶位點，通過非同源末端連接或同源重組進行修復以實現(xiàn)基因的敲除與修飾[22-23]。此外，Cas9蛋白還可在2個活性位點殘基(D10A和H840A)發(fā)生突變，失去啟動DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)的能力，形成所謂的CRISPR/dCas9系統(tǒng)，可用于干擾和激活基因表達[24]。表1比較了3種編輯技術(shù)的優(yōu)缺點。

圖1 ZFN的作用機制[9]Fig.1 The mechanism of ZFN[9]

圖2 TALEN的作用機制[12]Fig.2 The mechanism of TALEN[12]

圖3 CRISPR/Cas9工作機制[21]Fig.3 The mechanism of CRISPR/Cas9[21]

表1 新型基因編輯技術(shù)的比較Table 1 Comparison of new gene editing technologies

2 基因編輯技術(shù)在微藻中的應用

理論上，上述工具酶可以定點修飾任何物種的基因序列。它們結(jié)合到靶基因序列后，通過切割酶破壞靶DNA雙鏈，然后啟動非同源末端連接修復(nonhomologous end joining, NHEJ)或同源重組修復(homology-directed repair,HDR) 機制來修復靶基因，從而產(chǎn)生精確的定點修飾的靶基因而沒有插入任何外源DNA片段，這種定點修飾就成為可以在后代中穩(wěn)定遺傳的變異[25]，在微藻中同樣適用。

2.1 ZFN技術(shù)在微藻中的應用

ZFN技術(shù)應用于微藻的研究非常少，只有1例。2013年，Sizova等[26]首次將ZFNs技術(shù)應用于萊茵衣藻(Chlamydomonasrehardtii，常作為基礎和生物技術(shù)研究的通用模型)，利用ZFNs靶向突變編碼光敏一型視紫紅質(zhì)離子通道的COP3基因。ZFN的不同轉(zhuǎn)化效率是由敲除抗性或熒光標記等報告基因來評估的，并根據(jù)結(jié)果修飾優(yōu)化模塊組合，選出親和力和特異性最佳的核酸酶結(jié)合外源DNA共轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)對該藻株靶基因的定點敲除。這項技術(shù)不僅有助于衣藻單個基因功能的研究，而且還可以實現(xiàn)有效的基因定點修飾。

2.2 TALEN技術(shù)在微藻中的應用

TALEN誘導的靶向基因失活和靶向序列插入的方法，通過重塑硅藻新陳代謝方面的有效性在微藻中得到了證實。Daboussi等[27]首次將 TALEN 技術(shù)應用于硅藻的基因敲除。通過NHEJ介導的修復產(chǎn)生突變體，敲除了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中參與油脂代謝的關鍵基因，其中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UCPase)基因的敲除突變株的甘油三酯(triacylglycerol, TAG)含量相比野生型藻株提高了45倍，使突變體具有工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

之后的研究中，將TALEN表達盒與含有與TALEN靶位點同源序列側(cè)翼的抗生素抗性基因的“敲除質(zhì)粒”結(jié)合， TALEN與靶基因結(jié)合進行切割, “敲除質(zhì)粒”則通過HDR整合到基因組, 敲除三角褐指藻P.tricornutum的尿素酶基因, 基于HDR的靶向插入更易獲得突變體[28]。Hao等[29]通過TALEN基因組編輯技術(shù)破壞了P.tricornutum中硫酯酶基因，成功構(gòu)建了ptTES1基因的敲除突變株，結(jié)果表明盡管微藻生長受到損害，但與野生型菌株相比，ptTES1基因敲除突變體顯示出更高的TAG生產(chǎn)率，含量提高了1.7倍，證明了TALEN介導的靶基因敲除作為增強含油硅藻中TAG產(chǎn)生的有效策略的潛力。在最近的研究中，Kurita等[30]合成了編碼為產(chǎn)油微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)的Platinum TALENs，并通過在人HEK293T細胞中的單鏈退火實驗驗證了它們的DNA結(jié)合活性。以硝酸還原酶基因NoNR和酰基轉(zhuǎn)移酶基因LPAT1為靶點，將Platinum TALEN的多合一表達載體轉(zhuǎn)染到微綠球藻中。在N.oceanica候選位點沒有可檢測到的脫靶突變。同時引入TALENs靶向2個基因，獲得雙突變株。此外，這些多合一的TALEN載體在大腸桿菌中表現(xiàn)出高特異性和多重性。此研究為創(chuàng)造高性能藻類生物柴油的實際應用做出了貢獻。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在微藻中的應用

首次應用CRISPR/Cas9對微藻的研究中，Jiang等[31]將Cas9蛋白和sgRNA(simple guide RNA，sgRNA)基因通過電穿孔導入衣藻細胞的實驗，用非同源末端連接系統(tǒng)修復雙鏈斷裂，采用CRISPR/Cas9對微藻中的4個靶基因進行插入和缺失，成功在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) 細胞中表達Cas9蛋白與sgRNA，突變頻率達42.8%。然而，由于Cas9的毒性，未能獲得任何穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，嚴重降低了成功率。隨后有研究表明，通過運送包含Cas9蛋白和sgRNAs的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNPs)解決了這個問題，以避免與載體驅(qū)動的Cas9表達相關的細胞毒性和脫靶問題。在MAA7、CpSRP43和ChlM這3個位點獲得了CRISPR/Cas9誘導的突變，與首次報道的轉(zhuǎn)基因Cas9誘導突變相比，靶向誘變效率提高了100倍，通過使用Cas9 RNPs大大提高了基因敲除效率[32]。

Wang等[33]以硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)為例，在工業(yè)產(chǎn)油性海洋微綠球藻(Nannochloropsisspp.)中建立了一種精確基因組編輯方法，用質(zhì)粒載體介導的CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了微藻的1個硝酸還原酶基因，發(fā)現(xiàn)5 bp缺失突變體的比例超過1%，分離的突變體在NH4Cl作用下能正常生長，但在NaNO3作用下不能正常生長，是一個很有價值的轉(zhuǎn)NR基因的基礎菌株。有研究報道了在海洋微綠球藻中用CRISPR-Cas介導的基因組編輯的另一種方法：將RNP和編輯模板通過電穿孔直接導入微藻細胞，使Cas的表達可有可無，同源定向修復成為可能。Cas/RNPs與dsDNA修復模板的共導入有效地提高了靶位點的同源同組，產(chǎn)生了約70%的陽性突變系，陽性突變株比例顯著提高，有利于高效產(chǎn)生微綠球藻靶向突變體[34]。

海洋硅藻是真核微藻，在海洋中具有重要的生態(tài)作用，所以更需要建立簡單的CRISPR/Cas9體系。Nymark等[35]在三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中開發(fā)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，經(jīng)優(yōu)化后實現(xiàn)了穩(wěn)定的靶基因敲除。該系統(tǒng)發(fā)揮功能需要的2個組分，Cas9核酸酶和引導核酸酶指向特定DNA序列的引導RNA，都可以在同一載體中表達，結(jié)果在26個轉(zhuǎn)化實驗中有8個得到了突變子，突變頻率為31%。Moosburner等[36]提出了改進方法，改進后單基因和雙基因突變細胞系都是通過將1個選擇性Cas9和1個或2個sgRNAs接合后引入硅藻，同時利用陰性和陽性選擇的外顯子克隆策略，再利用人工測序、潮汐測序分析和T7核酸內(nèi)切酶分析，開發(fā)了細胞系篩選和基因分型策略，縮短產(chǎn)生突變體所需時間，結(jié)果單基因和雙基因敲除細胞系的突變率分別為48%和25%。

從微藻提煉油脂是解決石油枯竭和二氧化碳排放問題的一種可選擇、可持續(xù)、有前途的發(fā)展趨勢。鑒于微藻細胞生長和油脂含量的限制，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行改造具有重要意義。Lin等[37]證明農(nóng)桿菌介導的質(zhì)粒適合對小球藻(Chlorellavulgaris)進行基因插入，并以ω-3脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase 3，F(xiàn)ad3)基因為基礎構(gòu)建了結(jié)構(gòu)類似的含有Cas9片段的質(zhì)粒，該片段含有設計在Fad3基因上的sgRNA，在小球藻FSP-E中表達脂質(zhì)含量高達46%，這是首次成功將CRISPR/Cas9技術(shù)用于小球藻基因操作的案例。

本課題組目前正在進行微藻的相關研究，獲得了帶有 G418 抗性的Cas9質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到小球藻，為CRISPR/Cas9技術(shù)應用于小球藻提供參考[38]。

3 展望

ZFN和TALEN都是蛋白識別機制，CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別機制則是通過人工設計的sgRNA實現(xiàn)，操作簡便，便于上手，容易構(gòu)建。此外，CRISPR/Cas基因組編輯的效率和精確度通過不斷的努力得到了提高，包括Cas蛋白和sgRNA的不同表達策略，因而成為了主流的基因組編輯技術(shù)。

目前，基因組編輯技術(shù)主要是產(chǎn)生內(nèi)源基因功能缺失的突變體，對基因定點替換及基因的定點插入仍具有極大的挑戰(zhàn)性，無法做到對任一位點上高效地替換或插入任意序列，這就限制了基因組編輯技術(shù)在微藻中的應用。與此同時，微藻本身還有很多問題，由于它們獨特的細胞壁和表面結(jié)構(gòu)，很難將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞中，通常需去除細胞壁并使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，從而提高轉(zhuǎn)化效率。微藻可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上對引入的遺傳物質(zhì)(包括DNA和RNA)具有沉默機制，暫時抑制其中一個沉默組件可以提高其轉(zhuǎn)化效率。

隨著基因工程技術(shù)、生物信息學的飛速發(fā)展，微藻遺傳背景日趨明晰，對微藻進行基因改造已成為現(xiàn)實。新型基因編輯技術(shù)僅在萊茵衣藻、三角褐指藻、海洋微綠球藻等幾種微藻模型中進行了實驗，通過基因組、轉(zhuǎn)錄組學等方法對某些潛在菌株進行全面分析,深入研究將充分發(fā)揮新型基因編輯技術(shù)在更多微藻中的應用潛力，以更有效和更可行的方式從微藻中生產(chǎn)生物燃料或其他有價值的產(chǎn)品，有可能徹底改變未來高效和精確的基因工程解決方案，具有無可比擬的優(yōu)勢和發(fā)展前景。