Pseudomonas aeruginosa菌的原油除蠟降黏性能

王衛強， 吳尚書， 崔 靜， 鮑天宇， 張海娟， 張政一

(1.遼寧石油化工大學 石油天然氣工程學院,遼寧 撫順 113001；2.中國石油 內蒙古鄂爾多斯銷售分公司,內蒙古 鄂爾多斯 017000；3.遼寧石油化工大學 石油化工學院,遼寧 撫順 113001；4.中國石油 大慶石化公司,黑龍江 大慶 163000)

在原油開采及輸送過程中，當溫度和壓力降低時，石蠟在原油中的溶解度降低，出現蠟沉積現象[1-3]。蠟沉積會給原油開采及運輸帶來困難，導致生產效率降低、造成安全隱患[4]。此外，易凝原油中的長碳鏈烷烴在輸送過程中容易聚積，使原油黏度增加，流動性降低。因此，降解原油中的石蠟、降低原油的黏度、提高原油的流動性十分必要。

微生物清防蠟技術因具有成本低、效果好、無污染及作用周期長等特點被廣泛關注[5]。不同微生物對原油的作用效果不同；研究人員通過大量實驗篩選出能夠提高原油流動性能的微生物菌種。Amin等[6]從伊朗油田中篩選出一株地衣芽孢桿菌，其對原油降黏率為41.24%。王小通等[7]選用銅綠假單胞菌，配合嗜熱脂肪地芽孢桿菌和嗜熱脫氮地芽孢桿菌，將高凝油中長鏈飽和烴降解為短鏈烴，高凝油的黏度和瀝青質質量分數分別降低63.86%和31.35%。Puntus等[8]選用7種紅球菌對原油進行處理，其中活性最佳的菌種對原油的降解率為55%～59%。

綜上所述，不同微生物菌種提高原油流動性能的能力不同，篩選高效菌種是微生物清防蠟技術的關鍵。近年來，采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術在單細胞水平上篩選鑒別菌株活性的報道相繼出現。2015年，Berry等[9]采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術，實現在單細胞水平上對活性微生物進行識別和分類；2018年，Zhang等[10]采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術成功觀測到大腸桿菌進入活而不可培養態(VBNC)后代謝活性的變化；2019年，Li等[11]采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術，快速準確地篩選土壤中磷化物轉化性能最佳的解磷菌。在以石蠟為唯一碳源的條件下，活性越高的菌種，嗜蠟能力越強。因此，可采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術篩選原油的優勢嗜蠟菌。

筆者從遼河油田原油污染土壤中采集到5種嗜蠟菌，采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術篩選出其中的優勢嗜蠟菌種，確定其所屬菌屬；并優化其生長條件，進行排油圈及乳化性能測試，分析菌種代謝產物，測定其對原油的除蠟、降黏效果。

1 實驗部分

1.1 材料

采集嗜蠟菌種的原油污染土壤和原油樣品均取自遼河油田。從污染土壤中采集到5種嗜蠟菌，分別命名為CJ11、CJ12、LB7、LB8和SS1。原油 20 ℃ 密度為862 kg/m3，蠟質量分數為9.65%，36 ℃下表觀黏度為87.526 mPa·s。

試劑：酵母膏、胰蛋白胨、氯化鈉、氯化銨、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、磷酸一氫鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硝酸鈉(NaNO3)、營養瓊脂、三氯甲烷、甲醇、液體石蠟，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品；裂解液，生物試劑，日本TaKaRa公司產品。

3種培養基：(1)富集培養基：純水1000 mL、酵母膏5 g、氯化鈉5 g、氯化銨1 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KH2PO45 g，NaNO32 g。(2)液體石蠟培養基：純水1000 mL、K2HPO41.25 g、KH2PO41.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、氯化鈉5 g、氯化銨1 g、NaNO32 g、液體石蠟10 mL。(3)Luria-Bertani(LB)固體培養基：純水1000 mL、酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、營養瓊脂10 g。

1.2 優勢菌種的篩選

1.2.1 菌種采集

將5 g原油污染土壤加入到100 mL滅菌的富集培養基中，在37 ℃下培養24 h，取1 mL上清液轉接到30 mL新鮮富集培養基中培養24 h，重復轉接3次。然后，取1 mL上清液均勻涂布于LB固體培養基中[12]，在37 ℃下恒溫培養。待長出菌落后，使用接種環挑出形態大小不一的菌落，分別加入 30 mL 液體石蠟培養基中，培養12 h后進行平板劃線實驗，分離純化5種嗜蠟菌。

1.2.2 優勢菌種篩選

采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術確定優勢菌種[11]。取適量菌體，懸浮于體積分數30%的重水中，獲得菌懸液。重水與細胞充分結合，來自D2O的D同位素的引入導致部分菌種細胞中C—H鍵轉變為C—D鍵。D同化速率越快，C—D峰越強，菌種活性越高。采用拉曼光譜儀(LabRAM Aramis，Horiba Jobin Yvon S.A.S. 公司產品)檢測菌體細胞中C—D鍵波峰強度來確定優勢嗜蠟菌。

1.3 菌種生長條件優化

培養溫度優化：在液體石蠟培養基pH值為7、鹽(NaCl)質量濃度為5 g/L時，分別考察培養溫度為30、33、36、39、42 ℃時對菌株生長的影響。

培養基pH值優化：在溫度36 ℃、鹽質量濃度5 g/L時，考察培養基pH值分別為4、5、6、7、8、9時對菌株生長的影響。

鹽質量濃度優化：在溫度為36 ℃、pH值為7時，分別考察培養基鹽質量濃度分別為0、2.5、5、7.5、10 g/L時對菌株生長的影響。

采用酶標儀(Spectra Max ABS，美谷分子公司產品)測定菌培養物在波長600 nm下的光密度值(OD600 nm)，可得到菌種在不同溫度、pH值、鹽質量濃度下的生長曲線，確定出菌種的最佳生長溫度、pH值和鹽質量濃度。

1.4 菌種代謝產物分析

1.4.1 排油圈實驗

將1 mL油紅染色的液體石蠟滴加到30 mL滅菌純水上，形成油膜；取70 μL在富集培養基中培養48 h后的菌種上清液，滴加至油膜中心，觀察油膜變化。若菌種代謝產生表面活性劑，則油膜會被排開，形成排油圈。用相機拍攝，通過Nano Measure軟件進行直徑測量。

1.4.2 乳化實驗

取2 mL培養48 h的菌培養物和2 mL富集培養基，分別在5 mL離心管中與2 mL液體石蠟混合均勻，在36 ℃恒溫靜置24 h，測量乳化層高度(h)和混合液高度(H)，并計算乳化系數(E24，%)[13]，算式如式(1)。

(1)

1.4.3 表面活性劑的提取與鑒定

取培養48 h后的培養基上清液，調節pH值=2，靜置、離心、收集沉淀；將沉淀物溶于三氯甲烷和甲醇的混合萃取劑(V(CHCl3)∶V(CH3OH)=2∶1)中， 40 ℃下蒸干有機相得到生物表面活性劑[14]。采用傅里葉紅外光譜儀(iS10，Thermo公司產品)對表面活性劑進行分析。

1.5 菌種鑒定及其形態、性能表征

將優勢嗜蠟菌在LB固體培養基中培養，提取DNA，使用基因擴增分析儀器(PCR儀)(Mastercycler nexus gradient，Eppendorf公司產品)進行擴增。擴增產物由上海生工生物股份有限公司進行16S rRNA測序，以確定該菌種菌屬。

采用掃描電子顯微鏡(SEM)(S-4800，日本日立公司產品)觀察菌種形態。采用差示掃描量熱儀(Q2000 DSC，美國TA公司產品)測定嗜蠟菌處理120 h前后原油的含蠟量、析蠟點、析蠟高峰點。采用流變儀(HAKKE流變儀，上海珩璟科技有限公司產品)測量嗜蠟菌處理120 h前后原油黏度的變化。

2 結果與討論

2.1 優勢菌種篩選與鑒定

不同菌種的單細胞Raman-D2O同位素標記拉曼光譜圖如圖1所示。在菌懸液中，菌種與重水D元素同化量越大，即C—D峰越強，表明菌種活性越高。在菌懸液的Raman-D2O拉曼譜圖中，2040～2300 cm-1對應C—D鍵的振動吸收峰。由圖1可知，5種嗜蠟菌中，菌種SS1在2040～2300 cm-1內C—D峰的強度最大，即菌種SS1在以石蠟為唯一碳源的環境中代謝能力最強，為優勢菌種。另外，采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術篩選優勢嗜蠟菌所需時間為12～24 h，遠遠少于傳統方法所需的120～240 h。

圖1 不同嗜蠟菌種的單細胞Raman-D2O同位素標記拉曼譜圖Fig.1 Spectra of single-cell Raman-D2O isotope labelingwith different paraffin-degrading bacteria

采用掃描電子顯微鏡觀察優勢菌種的形態，如圖2所示。由圖2可知，菌種SS1呈長桿狀，無鞭毛，菌株大小為(0.4～0.7) μm×(3～4) μm。將菌種16S rRNA測序結果在NCBI數據庫中進行Blast比對，結果表明菌種SS1屬于銅綠假單胞菌屬，與Pseudomonasaeruginosa同源度達到100%，序列號為MH378333.1。

圖2 菌種SS1的掃描電鏡照片Fig.2 SEM image of strain SS1

2.2 菌種生長條件優化

2.2.1 SS1最佳生長溫度

圖3為菌種SS1在不同溫度下的生長曲線。由圖3可知，在30 ℃下，由于溫度過低，菌種蛋白活性低、代謝減緩、生長量較少[15]；隨著溫度的升高，菌種的代謝活性逐漸提高；在36 ℃下，菌種生長最為旺盛；當溫度繼續升高時，菌種的生長量反而降低。這是因為溫度過高時，細胞的蛋白結構被破壞，菌種生長受到抑制甚至失活[16-17]。菌種SS1在42 ℃下生長活性明顯較弱，說明該菌種對高溫耐受性差。因此，菌種SS1最佳生長溫度為36 ℃。

圖3 不同溫度下SS1菌種生長情況Fig.3 Growth of strain SS1 at different temperaturespH=7； ρNaCl=5 g/L

2.2.2 SS1最佳培養pH值

培養基pH值通過影響細胞質膜的通透性及穩定性來影響菌種對營養物質的吸收，從而影響菌種的生長速率。大多數菌種可生存的pH值范圍一般在4～9，根據菌種生長的最佳pH值不同，可將菌種分為嗜酸、耐酸、中性和耐堿、嗜堿菌[18]。菌種SS1在不同pH值下生長曲線如圖4所示。由圖4可知，在不同pH值下SS1菌種生長狀態有明顯差異。pH=7時，SS1菌種生長最為旺盛，說明SS1菌種為中性嗜蠟菌；當pH值為4、5時，由于H+濃度過高，細胞質膜穩定性低，菌種吸收營養物質的能力較弱，菌種生長緩慢；當pH值為8、9時，菌種蛋白酶活性較低，菌種代謝緩慢，生長速率降低。因此，菌種SS1最佳生長pH值為7，說明該菌適合生長于中性環境下，對偏酸性和偏堿性的環境適應能力較差。

2.2.3 SS1最佳生長鹽質量濃度

微生物對鹽濃度的適應范圍不同，鹽濃度是影響微生物生長的重要影響因素[19-20]，鹽濃度主要通過改變細胞的滲透壓來影響菌種的生長[21]。不同鹽質量濃度下，菌種SS1在生長情況如圖5所示，培養基的鹽質量濃度主要由其NaCl含量決定。由圖5可知，NaCl質量濃度為0和2.5 g/L時，由于滲透壓過低，大量水分子會滲入菌種細胞內，導致細胞破裂，菌種生長活性較低。當NaCl質量濃度為 5 g/L 時，菌種生長活性最佳。隨著NaCl質量濃度繼續提高，菌種生長環境滲透壓過大，導致細胞失水死亡。因此，菌種SS1最佳生長鹽質量濃度為5 g/L。

圖5 不同NaCl質量濃度下SS1菌種生長情況Fig.5 Growth of SS1 under different NaClmass concentrationsT=36 ℃； pH=7

2.3 菌種代謝產物分析

2.3.1 排油圈測試

菌培養物上清液滴加在油膜中心后，油膜向四周排開，形成穩定的排油圈，如圖6所示。排油圈直徑與菌種代謝生成生物表面活性劑的性能成正比，排油圈直徑較大說明菌種產生的生物表面活性劑性能較好[22]。經測量，菌種SS1培養物上清液的排油圈直徑(d)較大，為5.04 cm。這表明菌種SS1代謝產生的生物表面活性劑性能好，有助于提高蠟在原油中的溶解度，減少蠟組分的析出。

圖6 菌種SS1培養物上清液的排油圈照片Fig.6 Oil-displacement photo of strain SS1 medium supernatantd—The diameter of oil-displacement

2.3.2 乳化性能分析

菌種SS1培養物與液體石蠟混合靜置24 h后，出現明顯乳化層，如圖7所示。由圖7可知：空白培養基與液體石蠟不能形成乳狀液；菌種SS1培養物與液體石蠟形成水包油的乳狀液，其乳化層高度約為2.55 cm，乳化系數為63.75%。乳狀液能增加嗜蠟菌與蠟組分的接觸面積，提高嗜蠟菌的除蠟能力。因此，將菌種SS1引入原油中，能夠減少原油中蠟組分附著于采油設備及管道表面，達到除蠟、防蠟效果[23]。

圖7 菌種SS1培養物和空白培養基與液體石蠟的乳化效果Fig.7 Emulsifying results of strain SS1 culture medium anduntreated culture medium with liquid paraffin(a) Control group： Untreated culture medium with liquid paraffin；(b) Experimental group： Strain SS1 culture medium with liquid paraffin

2.3.3 表面活性劑提取與鑒定

菌種SS1代謝產物的傅里葉紅外光譜如圖8所示。圖8中，3214.34 cm-1處為N—H鍵伸縮振動引起的特征峰；2923.75與2858.57 cm-1為脂肪族的CH2對稱拉伸振動；1642.89 cm-1顯示酰胺的CO—N鍵拉伸振動；1387.64 cm-1處為CH3—基團做不對稱形變振動；1094.91 cm-1處是糖環縮醛結構C—O—C的振動；955.74 cm-1顯示為C—O鍵伸縮振動。綜上，菌種SS1代謝產物生物表面活性劑的特征峰與糖脂類化合物特征峰一致，表明該菌種在生長代謝過程中產生糖脂類生物表面活性劑。這與Nie等[24]研究結果一致。

圖8 菌種SS1代謝產物的紅外光譜Fig.8 Fourier infrared spectrum of strain SS1 metabolites

2.4 菌種的原油處理能力

2.4.1 菌種SS1的除蠟性能

經菌種SS1處理120 h前、后，原油析蠟過程的DSC熱譜圖如圖9所示；原油經菌種SS1處理120 h前后的析蠟性質見表1。由圖9可知：原油處理前析蠟點(TC)為24.49 ℃，蠟結晶釋放出的熱量Q1為20.272 J/g；經菌種處理后，析蠟點為24.42 ℃，蠟結晶釋放出的熱量Q2為9.496 J/g。經菌種SS1處理后，原油蠟結晶釋放出的熱量(Q)、析蠟點溫度(TC)與析蠟高峰點溫度(TP)均下降。由蠟結晶釋放出的熱量值，采用式(2)可計算原油中蠟的質量分數y。

(2)

圖9 原油經菌種SS1處理120 h前、后的析蠟過程的DSC熱譜Fig.9 DSC thermal spectra of wax evolution from crude oil before and after strain SS1 treatment for 120 h(a) Untreated sample； (b) Treated by strain SS1

由表1可以看出：由式(2)計算得到菌種SS1處理120 h前、后原油中蠟的質量分數分別為9.65%和4.52%。經菌種SS1處理后，原油中的蠟含量大幅降低，蠟去除率為53.16%，可有效減輕蠟沉積現象[15]。原油中蠟含量的降低、及析蠟點和析蠟高峰點降低，減少了蠟沉積現象出現，從而提高原油開采及運輸的安全性和經濟性。

表1 原油經菌種SS1處理120 h前、后的析蠟性質Table 1 Wax evolution properties of crude oil before andafter strain SS1 treatment for 120 h

2.4.2 菌種SS1的降黏性能

菌種SS1處理前、后原油的黏度變化如圖10所示。由圖10可知：在菌種SS1處理前，原油在非牛頓流體溫度段(27～43 ℃)的黏度范圍為14～301 mPa·s；菌種SS1處理后，原油在該溫度段的黏度范圍降至8～155 mPa·s；36 ℃下原油的降黏率達72.84%。原油經菌種SS1處理后黏度降低，是因為菌種以原油中長鏈烷烴為碳源進行生長代謝，將原油的長碳鏈烷烴降解為短碳鏈烷烴，降低原油中大分子組分的比例；同時菌種在生長代謝過程中產生生物表面活性劑，使原油分散乳化于水中，形成水包油乳狀液。兩方面共同作用使原油黏度降低，從而提高原油流動性能[25]。

圖10 SS1菌處理前、后原油黏度的變化Fig.10 The viscosity change of crude oil before andafter treated by SS1 bacteria

3 結 論

采用單細胞Raman-D2O同位素標記技術和16S rRNA測序鑒定，快速準確確定出遼河油田原油優勢嗜蠟菌種(SS1)為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；其最佳生長溫度為36 ℃，最佳生長pH值為7，最佳生長鹽(NaCl)質量濃度為5 g/L。

菌種SS1在生長代謝過程中產生糖脂類生物表面活性劑，其乳化系數為63.75%，能使原油形成水包油型乳狀液，提高蠟組分在原油中的溶解度。菌種SS1對原油處理120 h后，原油的蠟去除率為53.16%，降黏率達72.84%。說明菌種SS1對原油具有良好的除蠟、降黏作用，可以提高原油流動性。