CIAPIN1通過抑制ERK1/2途徑對膀胱尿路上皮癌增殖和轉移的作用研究

袁曉菲，彭洪濤

(1.河北省保定市第一醫院泌尿外科，河北 保 定 071000 2.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017)

尿路上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)主要由上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)和膀胱尿路上皮癌(Bladder urothelial carcinoma ，BC)組成。據估計，2018年美國新增UC病例為8.5萬，相關死亡病例為1.8萬。UC分別占男性和女性最常見惡性腫瘤的第4和第12位[1]。多發性病變、高復發率和遠處轉移是UC的典型特征。盡管外科技術不斷進步，術前、術后輔助治療不斷發展，但近年來UC患者的長期生存率并沒有明顯改變[2]。因此，探究UC的發病機制及新的治療靶點對UC的治療具有重要意義。細胞因子誘導的凋亡抑制因子1(Cytokine-induced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1)是一種新發現的凋亡相關蛋白，參與調控細胞凋亡、DNA斷裂和活性氧生成等細胞過程[3]。已有研究表明，CIAPIN1在膀胱癌組織中高表達，CIAPIN1在膀胱癌中的表達與病理分級、臨床分期和淋巴轉移相關[4]。細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinases，ERK)，包括ERK1和ERK2，其通過磷酸化激活后，ERK蛋白從細胞質轉移到細胞核中，在細胞核中傳遞信號。CIAPIN1通過抑制ERK1/2途徑磷酸化，調控乳腺癌細胞遷移、侵襲和細胞外基質降解過程[5]。目前，關于CIAPIN1在BC中的具體作用機制還尚未可知。因此，本研究旨在探究CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌增殖和轉移的作用及其作用是否通過ERK1/2途徑實現，以期為明確CIAPIN1在BC中的具體作用機制及發現新的UC治療靶點提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1材料：膀胱尿路上皮癌細胞系J82、T24和UM-UC-3購自美國模式培養物研究所；人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1購自上海酶研生物科技有限公司；ERK1/2途徑抑制劑U0126購自美國萊恩生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學研究所；陰性對照(NC)和siRNA-CIAPIN1(si-CIAPIN1)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司(takara中國)；CIAPIN1抗體購自英國Abcam公司；p-ERK1/2、ERK1/2和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)購自大連美侖生物技術有限公司；Apollo?567購自廣州市銳博生物科技有限公司；基質膠購自美國康寧(上海)有限公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養：J82、T24和UM-UC-3細胞用含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。SV-HUC-1細胞用含10%FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞每2天更換一次新鮮培養基。待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞后，進行后續實驗。

1.2.2CCK-8檢測細胞活力：將對數期生長的T24細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，繼續培養12h后，將細胞分為0μM組、5μM組、10μM組、20μM組、40μM組和80μM組，每組設置3個重復。按照分組，向細胞中添加不同濃度U0126，0μM組添加等量PBS。細胞繼續培養24h后，向每孔細胞中加入10μLCCK-8，37℃條件下孵育3h。酶標儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。細胞活力(%)=實驗組OD450nm /0μM組OD450nm×100%。

1.2.3細胞轉染：對數期生長的T24細胞按4×105個/孔密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后，將細胞隨機分為空白對照組、NC組和si-CIAPIN1組，按照Lipofectamine2000TM說明書進行NC和si-CIAPIN1的轉染。另外，將細胞隨機分為NC組、si-CIAPIN1組和si-CIAPIN1+ U0126組。按照分組，向細胞中添加U0126(20μM)，隨后按照Lipofectamine2000TM說明書進行NC和si-CIAPIN1的轉染。37℃、5%CO2條件下培養48h后，進行后續實驗。

1.2.4qRT-PCR檢測細胞CIAPIN1 mRNA表達水平：收集SV-HUC-1、J82、T24和UM-UC-3細胞，Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，將RNA逆轉錄合成cDNA。按照SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR實驗。反應條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個循環；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。CIAPIN1以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算其mRNA表達。CIAPIN1上游引物：5’-CACCAAGAAGTCTTCTCCTTCAGTG-3’，CIAPIN1下游引物：5’-GCTGAGAGGGTCCACAGCT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH下游引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.5Western blot檢測細胞CIAPIN1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達水平：收集SV-HUC-1、J82、T24、UM-UC-3細胞和轉染后的T24細胞，RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測定上清液的蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE分離并轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，加入CIAPIN1(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶2000)、ERK1/2(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)抗體，4℃孵育過夜。二抗(1∶5000)室溫孵育1h后，滴加ECL發光液到膜上，化學發光成像儀檢測蛋白條帶。

1.2.65-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)標記實驗檢測細胞增殖：對數期生長的T24細胞以2×105個/孔數量接種于24孔板中，按照1.4所示進行細胞轉染。48h后，根據說明書，向細胞中添加EdU至終濃度為10μM。繼續培養2h后，棄去培養基，4%多聚甲醛固定15min，0.5%Triton X-100穿透20min， Apollo?567避光染色30min，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染核5min。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞，其中藍色熒光代表細胞核，紅色熒光代表EdU陽性細胞。

1.2.7細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：對數期生長的T24細胞以2.5×105個/mL細胞密度接種于6孔板，每孔2mL，細胞置于37℃、5% CO2條件下培養24h。20μL槍頭沿著直尺，垂直于6孔板，進行細胞劃痕。PBS洗去漂浮細胞，加入無血清培養基。細胞繼續培養24h后拍照，Image J軟件分析細胞遷移距離。

1.2.8Transwell實驗檢測細胞侵襲：基質膠用無血清DMEM培養基稀釋。取100μL稀釋液加入各上腔室中，37℃孵育至凝固。上腔室加入100μLT24細胞懸液(5×104個細胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養基，37℃、 5%CO2條件下培養24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細胞中的表達：qRT-PCR和Western blot實驗結果顯示：與SV-HUC-1組相比，T24、UM-UC-3和J8兩組細胞中CIAPIN1 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，其中，T24組細胞變化最為明顯，因此選取T24細胞進行后續實驗。見圖1。

圖1 CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細胞中的表達

2.2CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞增殖的影響：EdU實驗結果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組EdU陽性細胞數明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 EdU實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞增殖的影響(×400)

2.3CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞遷移和侵襲的影響：細胞劃痕和Transwell實驗結果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細胞遷移距離和侵襲細胞數明顯降低(P<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 細胞劃痕實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞遷移的影響(×100)

圖4 Transwell實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞侵襲的影響(×400)

2.4CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞ERK1/2途徑的影響：Western blot檢測結果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細胞p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞ERK1/2途徑的影響

2.5U0126逆轉si-CIAPIN1對ERK1/2途徑的作用：CCK-8實驗結果顯示：與0μM組相比， 40μM組和80μM組T24細胞活力明顯降低(P<0.05)，而5μM、10μM和20μM差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6，因此，后續實驗U0126的使用濃度為20μM。Western blot實驗結果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細胞中p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與si-CIAPIN1組相比，si-CIAPIN1+ U0126組細胞p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖7。

2.6U0126逆轉si-CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞的作用：EdU、細胞劃痕和Transwell實驗結果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細胞EdU陽性細胞數、遷移距離和侵襲細胞數均明顯降低(P<0.05)；與si-CIAPIN1組相比，si-CIAPIN1+ U0126組細胞EdU陽性細胞數、遷移距離和侵襲細胞數均明顯升高(P<0.05)。見圖8、圖9和圖10。

圖6 CCK-8檢測U0126對T24細胞活力的影響

圖7 Western blot檢測U0126對細胞ERK1/2途徑的作用

圖8 EdU實驗檢測U0126對細胞增殖的影響(×400)

圖9 細胞劃痕實驗檢測U0126對細胞遷移的影響(×100)

圖10 Transwell實驗檢測U0126對細胞侵襲的影響(×400)

3 討 論

膀胱尿路上皮癌(BC)是世界上第九大常見的惡性腫瘤。盡管多數晚期BC患者通過一線鉑類化療后疾病控制率(DCR)可達大概65%～75%，但由于存在化療耐藥，他們的疾病無進展生存期(PFS)及總生存期(OS)往往較短。經過一線化療后，只有約25%～55%的患者有機會接受二線治療，但很多二線治療結局因疾病進展較快，而未能達到治療標準[6]。因此，探尋BC的發病機制及新的治療靶點對于改善BC疾病現狀具有重要意義。CIAPIN1被稱為抗凋亡分子，與包括Bcl-2和caspase家族成員在內的一系列凋亡分子沒有序列同源性。CIAPIN1已成為多種人類癌癥診斷、預后和治療靶標的候選指標[7]。因此，本研究以BC為研究對象，旨在探究CIAPIN1對BC的作用及其可能的機制，以期為BC的診斷和靶標治療提供新的科學資料。

CIAPIN1在不同癌癥中發揮著抗腫瘤或者促腫瘤作用。研究表明，CIAPIN1在人肺癌組織中顯著上調，敲低CIAPIN1可誘導非小細胞肺癌細胞周期阻滯和細胞凋亡[7]。CIAPIN1參與調控三陰性乳腺癌的多藥耐藥性，hsa-miRNA-143-3p通過靶向結合CIAPIN1提高三陰性乳腺癌細胞對化療藥物敏感性[8]。卵巢癌組織中CIAPIN1高表達，干擾CIAPIN1后可降低卵巢癌細胞存活率，促進細胞凋亡[9]。但在肝癌中，CIAPIN1發揮著抗腫瘤作用，過表達CIAPIN1可抑制肝癌細胞增殖和集落形成能力[10]。有研究表明，膀胱癌中CIAPIN1高表達，CIAPIN1的mRNA表達與增殖標志基因Cyclyin D1的mRNA表達呈正相關[11]。本研究結果顯示，CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細胞中高表達，敲低CIAPIN1后可抑制膀胱尿路上皮癌細胞的增殖和轉移，該結果說明，CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌中發揮著促腫瘤作用。

在海馬神經元細胞中，CIAPIN1通過調控Akt、MAPK、NF-κB和細胞凋亡信號通路參與細胞生存、DNA斷裂和活性氧生成的調節[12]。目前，在腫瘤相關的研究中，CIAPIN1對ERK1/2途徑的調控作用研究較為廣泛。ERK1(44kDa)及其同源亞型ERK2(42 kDa)參與調節細胞多種生理活動[13]。已有研究證明，在人慢性髓系白血病細胞中，敲低CIAPIN1后，ERK1/2磷酸化水平上調[14]。同樣的，在非小細胞肺癌細胞中，過表達CIAPIN1可抑制ERK1/2磷酸化水平[15]。然而，關于CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細胞中調節ERK1/2通路的作用的資料非常缺乏。本研究結果顯示，敲低CIAPIN1后，膀胱尿路上皮癌細胞中ERK1/2磷酸化水平升高，而ERK1/2途徑抑制劑U0126處理可逆轉敲低CIAPIN1后ERK1/2磷酸化水平的升高，逆轉敲低CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細胞的增殖和轉移的抑制作用。

綜上所述，本研究結果表明，CIAPIN1通過抑制ERK1/2磷酸化促進膀胱尿路上皮癌細胞的增殖和轉移。該研究結果為明確CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌中的作用及發現新的治療靶標提供了新的科學依據。