長鏈非編碼RNA富核轉錄本 1和INK 4位點反義非編碼RNA在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價值

周天磊，陳萍#，唐玲玲，汪毅

江蘇大學附屬醫院1呼吸內科，2中心實驗室，江蘇 鎮江 212001

胸腔積液是由各種疾病引起的常見并發癥，惡性疾病是胸腔積液的主要原因之一，約有2/3的惡性胸腔積液由肺癌、乳腺癌、淋巴瘤導致[1]。惡性胸腔積液的存在通常提示疾病已處于晚期，正確的診斷對進一步的治療至關重要，因此，新的腫瘤標志物用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷成為了研究的熱點。研究表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞的發生、發展中扮演著重要的角色[2]。研究顯示，長鏈非編碼RNA富核轉錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達，并且參與了腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移及凋亡[3-4]。INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）也有類似的報道，研究表明，ANRIL在肺癌和乳腺癌組織中的表達水平高于正常肺組織和乳腺組織，且促進了肺癌組織對順鉑的耐藥，并被認為可以作為腫瘤預后判斷的指標以及治療的靶點[5-7]。然而，NEAT1和ANRIL在良惡性胸腔積液中的表達水平尚不清楚。因此，本研究以良惡性胸腔積液患者作為研究對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測NEAT1與ANRIL在胸腔積液中的相對表達量，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年7月至2019年7月江蘇大學附屬醫院收治的100例胸腔積液患者。納入標準：①首次就診的胸腔積液患者；②良性胸腔積液患者的原發病灶均可通過臨床表現、體格檢查、實驗室檢查及影像學特征明確診斷；③惡性胸腔積液患者的原發病灶均可通過組織病理學或細胞學檢查明確診斷。排除標準：標本收集前患者采用過藥物治療。100例患者中，良性和惡性胸腔積液患者均為50例。良性胸腔積液患者中，男32例，女18例；年齡20～83歲，平均（63.30±14.08）歲；炎性胸腔積液17例，結核性胸腔積液27例，心功能不全、乳糜性胸腔積液、低蛋白血癥各2例。惡性胸腔積液患者中，男 28例，女 22例；年齡 41～86歲，平均（69.63±12.01）歲；肺癌41例（肺腺癌32例，肺鱗狀細胞癌6例，小細胞肺癌3例），卵巢癌2例，胃癌2例，惡性淋巴瘤2例，前縱隔B型胸腺瘤、前列腺癌及食管癌各1例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

Trizol試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成；QuantStudio?5實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司，Micro21R高速冷凍離心機購自美國Thermo公司，Colibri超微量分光光度計購自德國Berthold Detection Systems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胸腔積液處理 收集患者的胸腔積液標本200 ml，采用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min內進行如下處理：①將200 ml胸腔積液標本分裝于50 ml離心管內，4℃條件下1060 r/min離心5 min，棄上清留沉淀；②向沉淀中加入3000 μl紅細胞裂解劑，吹打混勻，并于4℃條件下520 r/min離心5 min，棄上清留沉淀；③加入3000 μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），吹打混勻，充分洗滌沉淀，繼續于4℃條件下1060 r/min離心5 min，棄上清；④重復②③步驟各1次，取沉淀加入1 ml Trizol液，吹打混勻后于-80℃凍存備用。同時留取10 ml胸腔積液標本進行癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）測定。

1.3.2 RNA提取 ①將上述處理后的標本常溫解凍，取500 μl，加入100 μl氯仿，充分振蕩，靜置5 min后，4℃條件下12 275 r/min離心15 min；②吸取上清液200 μl，加入等量異丙醇，上下顛倒后于室溫下靜置10 min，然后于4℃條件下12 275 r/min離心10 min，棄上清留沉淀；③向沉淀中加入500 μl 75%乙醇，充分振蕩洗滌沉淀，并于4℃條件下7970 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，重復洗滌兩次；④將沉淀置于室溫下干燥至無色透明，加入100 μl焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水充分溶解；⑤測定RNA的純度及濃度，D260nm/D280nm在1.8～2.0之間，濃度在300～500 ng/μl之間視為可用標本。

1.3.3 逆轉錄 根據PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書，于冰上配制逆轉錄反應液，RNA溶液和逆轉錄試劑總體積為20 μl。逆轉錄條件：37℃5 s，85℃15 min，4℃保存。合成的cDNA隨即可進行實時熒光定量PCR，也可置于-20℃冷凍備用。

1.3.4 實時熒光定量PCR 根據SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒說明書，于冰上配制PCR反應液，cDNA溶液和相應的PCR試劑總體積為20 μl。PCR反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃5 s，退火和延伸60℃34 s，共40個循環。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因。每個標本的兩個目的基因（NEAT1和ANRIL）和內參基因重復測定3次，記錄Ct值，3次測定的Ct值相差小于0.005視為可用Ct值，取均值。采用2-Ct法計算各個目的基因的相對表達量。所有基因的引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成。GAPDH上游引物為5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物為5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；NEAT1上游引物為 5'-TCCTTGCCTCCACTCCAATCCAG-3'，下游引物為5'-GCACTGCCATCAACACCTCCTG-3'；ANRIL上游引物為5'-AGCAGACATTGGAGTGAACGCATC-3'，下游引物為5'-TTGACTGGACCTGGTGGCTACG-3'。

1.4 觀察指標

以病理診斷結果為金標準，分析NEAT1、ANRIL和CEA對惡性胸腔積液的診斷效能。靈敏度=真陽性例數（/真陽性+假陰性）例數×100%，特異度=真陰性例數（/真陰性+假陽性）例數×100%，陽性預測值=真陽性例數（/真陽性+假陽性）例數×100%，陰性預測值=真陰性例數（/真陰性+假陰性）例數×100%，準確度=（真陽性+真陰性）例數/總例數×100%。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或近似t檢驗。根據NEAT1和ANRIL基因的相對表達量，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，獲取曲線下面積（area under the curve，AUC），依此確定臨界（cut-off）值，并通過計算靈敏度、特異度等指標評估兩種lncRNA對惡性胸腔積液的診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 良惡性胸腔積液中NEAT 1和ANRIL相對表達量的比較

良性胸腔積液中NEAT1的相對表達量為（0.020±0.013），明顯低于惡性胸腔積液的（0.075±0.047），差異有統計學意義（t=6.073，P＜0.01）。良性胸腔積液中ANRIL的相對表達量為（0.001±0.001），明顯低于惡性胸腔積液的（0.004±0.005），差異有統計學意義（t=3.463，P＜0.01）。

2.2 NEAT 1、ANRIL和CEA診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

ROC曲線分析結果顯示，NEAT1和ANRIL診斷惡性胸腔積液的AUC值分別為0.815（SE=0.042，95%CI：0.732～0.897）和 0.807（SE=0.043，95%CI：0.723～0.890），均大于CEA診斷惡性胸腔積液 的AUC值0.730（SE=0.051，95%CI：0.629～0.831）。此外，NEAT1和ANRIL聯合檢測診斷惡性胸腔積液的 AUC值為 0.894（SE=0.031，95%CI：0.833～0.954）。（圖1）

圖1 NEAT 1、ANRIL和CEA診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

2.3 NEAT 1、ANRIL和CEA對惡性胸腔積液的診斷效能

根據ROC曲線分析結果，確定NEAT1、ANRIL診斷惡性胸腔積液的臨界值分別為0.0501、0.0006，此時這兩個指標診斷惡性胸腔積液的靈敏度及特異度最佳。此外，臨床中通常將5.0 μg/L作為CEA的最高臨界值。NEAT1和ANRIL聯合檢測診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度均高于NEAT1、ANRIL和CEA單獨診斷的結果。（表1）

表1 NEAT 1、ANRIL和CEA對惡性胸腔積液的診斷效能（%）

2.4 不同臨床特征惡性胸腔積液患者中NEAT 1和ANRIL相對表達量的比較

不同腫瘤組織來源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史、糖尿病或心血管病發生情況的惡性胸腔積液患者中NEAT1和ANRIL的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

3 討論

惡性胸腔積液診斷的金標準是組織活檢和細胞學檢查。胸膜組織活檢具有較高的陽性率，但操作復雜，創傷性和風險較大，而細胞學檢查雖然操作簡便，但靈敏度較低[8-9]。近年來，臨床中采用腫瘤標志物鑒別良惡性胸腔積液，CEA被認為是最具有臨床價值的腫瘤標志物。盡管有研究報道了CEA鑒別良惡性胸腔積液的臨床價值，但其靈敏度和特異度均不理想[10]。隨著基因組技術的不斷發展，越來越多的研究表明lncRNA不僅能夠在腫瘤組織中被檢測出，參與惡性腫瘤的發生、發展、轉移和侵襲，而且在腫瘤患者的血清、尿液、胸腔積液等易于獲得的體液中也均被檢測出[11-12]。本研究選擇了NEAT1和ANRIL作為目的基因，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價值。

表2 不同臨床特征惡性胸腔積液患者中NEAT 1和ANRIL的相對表達量（ n=50）

NEAT1是新發現的一種限制性lncRNA，被譽為眾多基因的轉錄調控因子。近年來的一些研究表明，NEAT1通過多種細胞信號轉導途徑參與了腫瘤組織的增殖和侵襲。Li等[13]研究發現，NEAT1在肺癌組織中高表達，高表達的NEAT1抑制了高遷移率族蛋白2（high mobility group box protein 2，HMGB2）的表達，從而降低了微小RNA（microRNA，miRNA）-181a-5p的表達水平，促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲。Jiang等[4]研究表明，NEAT1在乳腺癌中高表達，并且可以作為競爭性內源RNA，通過與miRNA-448競爭性結合E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1），從而參與乳腺癌的進展。該研究還證明，NEAT1在肺癌和乳腺癌中的表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移和臨床分期有關，并且可以作為腫瘤預后的判斷指標。本研究結果表明，NEAT1在惡性胸腔積液中的相對表達量明顯高于良性胸腔積液（t=6.073，P＜0.01），與上述研究結果相符。本研究結果還顯示，不同腫瘤組織來源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史、糖尿病或心血管病發生情況的惡性胸腔積液患者中NEAT1的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），說明惡性胸腔積液患者中NEAT1的表達水平與上述臨床特征無關。

ANRIL最先在黑色素瘤中被發現和命名[13]。全基因組關聯研究將ANRIL基因作為冠狀動脈疾病、顱內動脈瘤、2型糖尿病和惡性腫瘤共同的遺傳易感基因位點，使得ANRIL逐漸成為研究的熱點[14-15]。越來越多的研究證實，ANRIL在多種腫瘤中發揮著癌基因的作用。Zhang等[16]的研究證實了ANRIL在胃癌組織中高表達，并通過與多梳抑制復合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）結合調控雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）和周期蛋白依賴性激酶 6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）/E2F轉錄因子 1（E2F transcription factor 1，E2F1）通路并沉默miRNA-99a/miRNA-449a的表達，從而促進腫瘤細胞生長。Nie等[5]研究發現，ANRIL可以通過直接與PRC2的核心亞基zeste增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）結合沉默KLF2的表達以及抑制p21的轉錄，從而參與腫瘤細胞的增殖。此外，Xu等[17]的研究表明，ANRIL在三陰性乳腺癌中呈高表達，并通過與miRNA-199a的相互作用抑制miRNA-199a的抑癌作用。本研究結果顯示，惡性胸腔積液中ANRIL的相對表達量明顯高于良性胸腔積液（t=3.463，P＜0.01），且不同腫瘤組織來源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史的惡性胸腔積液患者中ANRIL的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），說明惡性胸腔積液患者中ANRIL的表達水平與上述臨床特征無關。有研究表明，ANRIL還與冠狀動脈疾病、2型糖尿病等多種人類疾病相關[18-19]。因此，本研究分析了惡性胸腔積液患者中ANRIL表達情況與糖尿病或心血管疾病的關系，結果顯示，有糖尿病或心血管疾病和無糖尿病或心血管疾病的惡性胸腔積液患者中ANRIL的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），排除了糖尿病或心血管疾病對惡性胸腔積液患者中ANRIL表達情況的影響。

本研究結果顯示，NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的相對表達量均明顯高于良性胸腔積液，二者診斷惡性胸腔積液的AUC值分別為0.815和0.807，均大于CEA診斷惡性胸腔積液的AUC值0.730。NEAT1和ANRIL聯合檢測診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度均高于NEAT1、ANRIL和CEA單獨診斷的結果。NEAT1診斷惡性胸腔積液的靈敏度和特異度分別為78.0%和84.0%，與CEA的76.0%和82.0%差異不明顯。而ANRIL診斷惡性胸腔積液的靈敏度為84.0%，高于CEA的76.0%，但特異度僅為58.0%，假陽性率和誤診率較高。NEAT1和ANRIL聯合檢測時，其靈敏度和特異度分別為86.0%和92.0%，均高于CEA，假陽性率降低，準確度升高。表明聯合檢測胸腔積液中的腫瘤標志物對良惡性胸腔積液的鑒別診斷作用更為顯著。此外，本研究結果顯示，肺癌和非肺癌患者惡性胸腔積液中NEAT1和ANRIL的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的表達水平與患者的腫瘤組織來源無關。由于樣本主要來源于肺癌，胸腔積液的出現往往提示疾病進入晚期，本研究未能對腫瘤分期進行相關分析，后續將繼續擴大樣本量，進一步分析腫瘤分期與惡性胸腔積液中NEAT1和ANRIL表達的關系。

綜上所述，NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的表達水平均高于良性胸腔積液，且其在惡性胸腔積液中的表達水平與腫瘤組織來源、年齡、性別等無關。NEAT1和ANRIL表達水平的檢測對良惡性胸腔積液的鑒別診斷具有一定的臨床意義，有可能成為鑒別良惡性胸腔積液的生物標志物，而二者聯合檢測可進一步提高良惡性胸腔積液的診斷效能。