鈾脅迫對不同苔蘚光合特性及礦質營養代謝的影響

鄧章軒，賴金龍,2，張 宇，羅學剛,2

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學生物質材料教育部工程研究中心，四川 綿陽 621010）

【研究意義】核電行業的發展為我國國防和經濟建設帶來巨大利益的同時，也留下了許多需要環境治理的鈾礦區。礦區土壤含鈾量和輻射量是一般土壤的幾十倍，容易通過雨水污染周邊環境，對動植物生長發育造成傷害[1-2]。生物修復技術由于操作性強、成本低廉且不會造成二次污染，被認為是最具潛力的環境修復技術。但礦區環境存在水土流失、土層稀薄等問題，難以滿足一般維管束植物的立地條件。苔蘚作為先鋒植物被廣泛用于惡劣環境的生態修復，研究苔蘚植物對鈾脅迫的生理響應，篩選適用于鈾污染修復的苔蘚植物，提高生物修復效率，對改善和修復鈾礦區生態環境具有重要意義。

【前人研究進展】鈾以鈾酰離子（UO22+）的化合形式與碳酸鹽、硫酸鹽等形成可溶化合物，被植物吸收后引起植物不同部位出現氧化應激和細胞氧化還原失衡現象，導致植物葉片枯黃，生物量下降[3-4]。鈾脅迫會干擾植物的光合作用，葉綠素熒光技術能反映植物受到鈾脅迫時光合系統中光能傳遞、利用和耗散等相關信息[5-6]。鄧聞楊等[7]通過鳳眼蓮的熒光生理特性變化研究微生物對鳳眼蓮鈾富集能力的影響；韓旭等[8]利用葉綠素熒光技術研究鈾脅迫對兩種植物的光合系統的影響，以評價兩種植物對鈾脅迫的耐受性。此外，鈾脅迫能影響植物對營養物質的吸收和轉運，擾亂植物的新陳代謝。研究表明，UO22+會與Ca2+搶奪細胞膜上結合位點，降低細胞膜上的穩定性，改變礦質元素的滲透性[9]，導致植物礦質營養代謝紊亂[10-11]。苔蘚植物體型矮小、結構簡單，表面無角質層覆蓋，對重金屬污染敏感，常被用于環境重金屬污染研究[12-14]。衣艷君等[15]研究發現Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+復合脅迫能抑制尖葉走燈蘚的最大光合效率（Fv/Fm），降低光合系統的電子傳遞速率和捕光能力。魏海英等[16]研究發現Pb、Cd脅迫會降低苔蘚植物葉綠素含量，并抑制苔蘚植物的K元素的吸收。苔蘚植物生命力強，能夠適應惡劣的生長環境[17-18]。研究表明，苔蘚植物對重金屬的富集能力強于地衣和維管植物[19]，可考慮作為鈾礦區環境污染的監測和修復植物，然而目前關于苔蘚植物對鈾脅迫的生理響應研究較少。

【本研究切入點】以灰蘚原變種（Hypnum cupressiformeL. ex Hedw. var.cupressiforme）、大羽蘚（Thuidium cymbifolium）和東亞砂蘚（Racomitrium japonicum） 3種苔蘚為試驗材料，研究鈾脅迫對苔蘚植物的葉綠素熒光生理特性和礦質元素積累的影響以及3種苔蘚對鈾的積累能力。【擬解決的關鍵問題】為苔蘚植物用于修復和監測環境鈾污染提供數據參考和科學依據，探究苔蘚植物用于鈾礦區環境修復的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年夏在西南科技大學生物質材料教育部工程研究中心進行。選用苔蘚品種為灰蘚原變種、大羽蘚和東亞砂蘚，均采自西南科技大學青義校區內。苔蘚采回實驗室后，挑除里面的雜草樹枝，用去離子水反復沖洗數次以去除表面雜質，再將苔蘚放入霍格蘭營養液中適應培養3 d，最后挑選生長狀態良好的苔蘚作為試驗材料。

1.2 試驗方法

以硝酸鈾酰〔UO2（NO3）26H2O〕為鈾源，根據鈾脅迫對其他植物產生較強毒害作用的濃度[7,20]以及苔蘚植物對其他重金屬的耐受濃度[21-22]，設0、2.5、5、10、20 mg/L 5個鈾脅迫濃度處理，依次記為CK、T1、T2、T3、T4，每個處理3次重復。為避免鈾酰離子（UO22+）與磷酸鹽形成沉淀，試驗選用改良Hoagland’s營養液[23]。稱取適量硝酸鈾酰配制成相應鈾濃度的營養液，將苔蘚植物放置在含鈾營養液中，光照培養72 h。設置培養箱溫度為25 ℃，濕度80%，光照周期為14 h∶10 h，光照強度為2 000 lx[24]。培養72 h后，用蒸餾水沖洗苔蘚3次，濾紙吸干表面水分，測其葉綠素含量、葉綠素熒光參數、鈾累積量以及礦質元素含量。本試驗所用藥劑均為分析純。

1.3 掃描電鏡和能譜分析

取3種苔蘚對照和鈾脅迫濃度20 mg/L處理的葉片，用蒸餾水沖洗后，用電鏡固定液固定24 h。將固定后的葉片用蒸餾水清洗數次，液氮快速冷凍，放入真空冷凍干燥機干燥。干燥后的苔蘚葉片噴金后，用場發射掃描電子顯微鏡觀察并拍照[24]，用ImageJ 軟件測量葉片絨毛長度。

1.4 葉綠素含量測定

稱取0.2000 g苔蘚樣品葉片，剪碎后放入研缽，加入95%乙醇5 mL和適量石英砂，研磨后定容至10 mL，用離心機3 000 r/min離心5 min，取上清液，用分光光度計在665、649 nm處測定吸光度值，計算葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、總葉綠素（Chl a+b）含量（g）及葉綠素a/b[25]。

式中，V為提取液體積（mL），W為植物鮮重（g）。

1.5 葉綠素熒光參數測定

葉綠素熒光參數采用MINI-PAM便攜式熒光測定儀測定。將樣品暗適應20 min后，測其最大光化學量子產量Fv/Fm、光化學淬滅系數qP、非光化學淬滅系數qN、實際光化學量子產量Y（Ⅱ）[21]。

1.6 礦質元素和鈾含量測定

將苔蘚樣品于105 ℃殺青后，置于85 ℃烘箱中烘干，然后用微型植物粉碎機粉碎，過0.075 mm篩后取0.1000 g樣品粉末，加9 mL HNO3和1 mL H2O2，用微波消解儀消解后用去離子水定容至50 mL，過濾后使用原子吸收分光光度計測定礦質元素含量[23]。稱取樣品粉末0.2000 g，放入制樣模具中，使用玻璃棒將樣品測試面平整，封口后用X射線熒光光譜分析儀測定U的含量[27]。

試驗數據使用DPS 7.05軟件進行單因素方差分析和Tukey多重比較，采用Microsoft Excel 2007作圖，采用Adobe Illustrator CC 2019進行圖片排版。

2 結果與分析

2.1 鈾脅迫對3種苔蘚葉綠素含量的影響

鈾脅迫對3種苔蘚植物葉綠素含量影響情況如表1所示。大羽蘚的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量以及灰蘚原變種的葉綠素a含量在鈾脅迫濃度2.5 mg/L下發生顯著降低，東亞砂蘚的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量在鈾脅迫濃度10 mg/L下發生顯著降低，說明東亞砂蘚對鈾脅迫的耐受性強于灰蘚原變種和大羽蘚。當鈾脅迫濃度升高至為20 mg/L，3種苔蘚的葉綠素含量均降到最低值，灰蘚原變種、大羽蘚和東亞砂蘚葉綠素a含量分別降低57.4%、72.1%、49.6%，葉綠素b含量分別降低40.9%、75.0%、49.4%，總葉綠素含量分別降低50.7%、72.8%、49.5%。3種苔蘚中，大羽蘚的葉綠素含量降幅最大，首次出現顯著降低的脅迫濃度最低，說明大羽蘚對鈾脅迫的敏感性最高，東亞砂蘚對鈾脅迫的耐受性最好。灰蘚原變種葉綠素a/b值在20 mg/L鈾脅迫下較對照顯著降低24.4%，說明葉綠素a對鈾脅迫更敏感。

表1 鈾脅迫下3種苔蘚植物的葉綠素含量Table 1 Chlorophyll contents of three bryophytes under uranium stress

圖1 鈾脅迫對3種苔蘚植物葉綠素熒光參數的影響Fig. 1 Effects of uranium stress on chlorophyll fluorescence parameters of three bryophytes

2.2 鈾脅迫對3種苔蘚光合特性的影響

3種苔蘚的最大光化學量子產量Fv/Fm、有效量子產量Y（Ⅱ）、光化學淬滅系數（qP）和非光化學熒光淬滅系數qN對鈾脅迫的響應如圖1所示。低濃度鈾脅迫（2.5 mg/L）下，3種苔蘚的Fv/Fm未出現顯著變化，東亞砂蘚的Y（Ⅱ）和qP及灰蘚原變種的qN出現顯著升高。當鈾脅迫濃度升至10 mg/L時，灰蘚原變種的Y（Ⅱ）、qP和qN均出現顯著升高并達到最高值，大羽蘚的Y（Ⅱ）、qP和 qN則出現顯著降低。當鈾脅迫濃度達到20 mg/L，灰蘚原變種的Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP和qN較鈾脅迫10 mg/L下皆有降低，大羽蘚的Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP和qN均出現顯著降低并達到最低值，東亞砂蘚的qN則出現顯著升高。說明鈾脅迫對敏感性較高的苔蘚品種（大羽蘚）的葉綠素熒光參數均表現為抑制作用，耐受性較好的品種多表現為“低促高抑”，如灰蘚原變種的Y（Ⅱ）、qP、qN和東亞砂蘚的Y（Ⅱ）、qP。東亞砂蘚的Y（Ⅱ）和qP在低濃度鈾脅迫（2.5 mg/L）下出現顯著升高，Fv/Fm和qN表現為無變化和顯著上升，因此不能確定東亞砂蘚對鈾脅迫的最高耐受濃度。灰蘚原變種對鈾脅迫耐受的最高濃度為10 mg/L，大羽蘚對鈾脅迫的敏感性最高，鈾脅迫濃度≥5 mg/L部分葉綠素熒光生理參數開始出現顯著降低。

2.3 不同苔蘚鈾累積能力分析

掃描電鏡圖片（圖2）顯示，3種苔蘚的葉片表面均附著絨毛，表2顯示3種苔蘚中大羽蘚的葉片絨毛長度顯著大于灰蘚原變種和東亞砂蘚，鈾處理后葉片絨毛長度并未出現顯著變化；能譜分析結果顯示，高濃度鈾脅迫（20 mg/L）下，3種苔蘚葉片表面均存在鈾元素。表3顯示，大羽蘚的鈾累積量在各處理間均顯著高于灰蘚原變種和東亞砂蘚。20 mg/L鈾脅迫下，大羽蘚的鈾累積量為灰蘚原變種的1.37倍、東亞砂蘚的1.34倍。說明鈾脅迫對苔蘚植物葉片絨毛長度無顯著影響，大羽蘚的葉片絨毛長度大于灰蘚原變種和東亞砂蘚，對鈾的累積能力優于灰蘚原變種和東亞砂蘚。

2.4 鈾脅迫對3種苔蘚礦質營養代謝的影響

圖2 鈾脅迫苔蘚掃描電鏡及能譜分析Fig. 2 SEM and EDS analysis of bryophytes under uranium stress

表2 3種苔蘚葉片的絨毛長度Table 2 Length of leaf villi of three bryophytes（μm）

表3 不同品種苔蘚對鈾的累積量Table 3 Accumulation of uranium in different bryophytes（mg/kg, DW）

圖3 鈾脅迫下3種苔蘚植物礦質元素含量變化Fig. 3 Changes of contents of mineral elements in three bryophytes under uranium stress

3種苔蘚的礦質元素對鈾脅迫的響應趨勢如圖3所示。鈾脅迫下大量元素K含量在灰蘚原變種和大羽蘚中顯著升高16.1%和10.3%，在東亞砂蘚中無變化；Ca含量在灰蘚原變種和東亞砂蘚中顯著升高41.3%和341%，在大羽蘚中表現為“低促高抑”現象，在2.5 mg/L時取得最大值，較對照顯著升高17.6%，脅迫濃度繼續上升則出現顯著降低。說明一定濃度的鈾脅迫能促進苔蘚植物吸收大量元素K、Ca，脅迫濃度過高則會抑制，對鈾脅迫敏感性較高的大羽蘚最先出現顯著降低。灰蘚原變種和大羽蘚的大量元素Mg出現顯著降低，東亞砂蘚無顯著變化，Mg元素為葉綠素重要組成部分，東亞砂蘚對鈾脅迫的耐受性較好，Mg元素未表現出顯著下降。

微量元素中灰蘚原變種的Fe、Mn、Cu、Mo含量出現顯著變化，最高值較對照分別顯著升高7.9%、21.8%、42.6%和432%；大羽蘚的Fe、Mn、Mo含量最高值較對照顯著升高68.4%、29.3%和321%；東亞砂蘚的Zn、Mn、Mo含量最高值較對照顯著升高73.9%、27.1%和257%。其中Mo含量在3種苔蘚中皆呈上升趨勢，升幅最大，說明鈾脅迫能促進苔蘚植物對Mo元素的吸收；Fe、Mn、Cu、Zn含量在3種苔蘚中變化趨勢各不相同，說明鈾脅迫對苔蘚植物微量元素的影響存在種間差異，需要進一步深入研究。

3 討論

與其他高等植物一致，葉綠素含量變化也是苔蘚植物受到環境脅迫時的生理響應之一。劉濤等[22]研究發現Pb2+、Zn2+及二者復合脅迫對西南樹平蘚的葉綠素含量均抑制顯著。董萌等[27]研究表明，東亞金發蘚葉綠素含量與土壤中鎘濃度呈反比例關系，鎘脅迫會使苔蘚葉片枯黃萎蔫，甚至枯亡。本研究結果與前人研究結果相似，苔蘚植物的葉綠素含量與鈾脅迫濃度均呈反比例關系。大羽蘚的葉綠素含量和灰蘚原變種的葉綠素a含量在低濃度鈾脅迫（2.5 mg/L）下出現顯著降低，東亞砂蘚的葉綠素含量出現顯著變化的鈾脅迫濃度10 mg/L，高濃度鈾脅迫（20 mg/L）下大羽蘚的葉綠素含量降幅最大，說明3種苔蘚對鈾脅迫的敏感性依次為大羽蘚＞灰蘚原變種＞東亞砂蘚。高濃度鈾脅迫下葉綠素a/b在灰蘚原變種中出現顯著降低，說明葉綠素a對鈾脅迫更加敏感，但大羽蘚和東亞砂蘚中并未出現顯著變化，因此葉綠素含量變化作為篩選鈾污染修復植物的指標需要考慮葉綠素a和葉綠素b及總葉綠素的含量。

葉綠素熒光參數能反映植物受到重金屬脅迫時植物光合作用變化，韓旭等[9]研究發現，水芹和銅錢草的Fv/Fm隨著鈾脅迫濃度增加而降低。李華麗等[28]發現高濃度鈾脅迫可使植物PSⅡ的Fv/Fm降低，嚴重威脅植物存活。本研究發現3種苔蘚的葉綠素熒光參數對鈾脅迫響應變化不一致。Fv/Fm能反映植物潛在的最大光合效率，Y（Ⅱ）反映植物實際光合效率。隨著鈾脅迫濃度增加，灰蘚原變種和大羽蘚的Fv/Fm在較高濃度鈾脅迫（≥10 mg/L）下出現顯著降低，灰蘚原變種和東亞砂蘚的Y（Ⅱ）表現為“低促高抑”，大灰蘚的Y（Ⅱ）表現為被抑制，說明苔蘚植物的實際光合效率對鈾脅迫更敏感，容易產生顯著效應，一定濃度的鈾脅迫能提高耐受性較好的苔蘚植物的實際光合效率。光化學淬滅系數（qP）和非光化學猝滅系數（qN）反應吸收的光能用于光化學和熱能的部分。灰蘚原變種和東亞砂蘚的qP隨著鈾濃度呈“低促高抑”現象，說明低濃度鈾脅迫促進苔蘚植物的光合活性，濃度過高則抑制。灰蘚原變種qN表現為“低促高抑”，東亞砂蘚qN顯著升高，大羽蘚的qN、qP均被抑制，說明灰蘚原變種和東亞砂蘚可能通過將光能更多的轉換為熱能的方式以減少鈾脅迫對其PSⅡ的傷害。鈾脅迫對大羽蘚的毒害性較強，使其PSⅡ結構受損，導致光合活性和光保護能力同時受到抑制，實際光合效率下降[29]。

龔雙姣等[30]研究發現對鉛耐受性最強的尖葉擬船葉蘚對鉛的富集量最多。本研究發現，對鈾敏感性較高的大羽蘚，對鈾富集量各處理間皆顯著高于耐受性較好的灰蘚原變種和東亞砂蘚。有學者認為認為苔蘚植物對重金屬的富集能力和敏感性存在種間差異，主要受苔蘚植物比表面積、表面特征結構及持水能力影響[31]。本研究結果顯示，苔蘚植物葉片的絨毛長度與鈾累積量呈正比例關系，大羽蘚的葉片絨毛長度大于灰蘚原變種和東亞砂蘚，更容易吸附和滯留鈾離子，可能是大羽蘚鈾累積量大于灰蘚原變種和東亞砂蘚的原因之一。此外，耐受性較好的苔蘚品種為了阻止重金屬離子進入體內，會形成相應的阻隔屏障，降低重金屬在體內的運輸效率，以減少對細胞的損傷，如匐枝青蘚通過細胞壁表面形成的有效屏障抑制對Pb元素的吸收以耐受600 mg/L的Pb毒害作用[31]，這也可能是耐受性較好的東亞砂蘚和灰蘚原變種的鈾富集量低于大羽蘚的原因。結合鈾在巖石、土壤、水和生物體中平均含量約為4 mg/kg[32]，接近大羽蘚對鈾脅迫的最高耐受濃度5 mg/L，大羽蘚對鈾污染更加敏感，對鈾污染易產生顯著生理響應，相同濃度鈾脅迫下鈾富集量高于灰蘚原變種和東亞砂蘚，因此大羽蘚更適合用于環境鈾污染的監測和修復研究。

礦質元素平衡是植物維持正常生理活動的必需條件之一，重金屬脅迫可使植物礦質元素吸收、轉運和代謝異常。K、Ca、Mg是植物生長發育所需的大量元素。本研究發現，鈾脅迫下，K、Ca含量分別在兩種苔蘚中表現為顯著上升，與謝亞兵等[33]關于Cd脅迫對芳樟K、Ca吸收的影響研究結果相似，原因可能是較低的濃度鈾脅迫使苔蘚植物增加對K、Ca的吸收，促進呼吸和光合作用相關酶的活性，加快糖類的轉運，以抵抗鈾脅迫對細胞的傷害。大羽蘚的Ca含量表現為 “低促高抑”，這與魏海英[34]對Pb-Cd復合脅迫下大羽蘚Ca含量研究結果相似，結合大羽蘚葉片表面結構容易滯留鈾離子，推測原因是葉片表面大量被吸附的鈾離子破壞了細胞膜結構穩定性，使Ca含量降低。灰蘚原變種和東亞砂蘚對鈾的累積能力弱于大羽蘚，還未表現出下降趨勢。兩種苔蘚的Mg含量出現顯著下降，推測是因為葉綠素的分解導致苔蘚植物細胞Mg含量降低。

微量元素是組成植物生長代謝相關酶的重要成分之一。本研究結果顯示，鈾脅迫下東亞砂蘚Fe，Zn、Mn含量表現為 “低促高抑”，與劉帥等[35]關于Cd脅迫下菜心地上部Fe、Zn、Mn含量變化研究結果相似，灰蘚原變種和大羽蘚的Fe含量呈下降趨勢，原因可能是低濃度的鈾脅迫使東亞砂蘚胞內氧化還原反應效率升高，促進Fe吸收，而灰蘚原變種和大羽蘚在低濃度鈾脅迫時細胞色素解體，導致Fe含量降低。3種苔蘚的Mo含量均表現為上升，而且在高濃度鈾脅迫（20 mg/L）有一個較大幅度提升，推測苔蘚植物可能通過促進氮代謝能力以抵抗鈾脅迫傷害，但還需要進一步研究鈾脅迫下苔蘚的氮代謝相關酶活性加以驗證。

4 結論

本研究結果表明，苔蘚植物的葉綠素含量與鈾脅迫濃度呈反比例關系；葉綠素熒光生理參數在敏感性較高的苔蘚中表現為被抑制，對鈾耐受性較好的苔蘚中多表現為“低促高抑”；一定鈾脅迫能夠促進苔蘚植物對大量元素K、Ca含量的吸收，濃度過高則會抑制；因此葉綠素含量、葉綠素熒光生理特性及大量元素K、Ca含量可作為篩選鈾污染監測和修復植物的生理指標。

大羽蘚葉綠素含量出現顯著變化的鈾脅迫濃度最低，葉綠素含量降幅最大，對鈾脅迫的敏感性較東亞砂蘚和灰蘚原變種最高，葉綠素熒光生理參數顯示大羽蘚對鈾脅迫的最高耐受濃度為5 mg/L，接近鈾在巖石、土壤、水和生物體中平均含量，且對鈾的富集能力優于灰蘚原變種和東亞砂蘚，可作為監測以及修復環境鈾污染的優選苔蘚植物。