膠體金法檢測SARS-CoV-2總抗體的檢測性能評價與探討

陶 然，莫南勛，李 玲，李慧源，李根石，鄧小燕，陳建波,4，何 君,5，程雅婷,5，周 妍，謝 文，張 玲,6△

1.廣州金域醫學檢驗中心，廣東廣州，510005；2.廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510006；3.武漢金域醫學檢驗所，湖北武漢 430100；4.國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心病毒診斷研究分中心，湖北武漢 430100；5.國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心病毒診斷研究中心，廣東廣州 510005；6.武漢雷神山醫院，湖北武漢 430200；7.上海市第一人民醫院，上海 200003；8.武漢大學中南醫院，湖北武漢 430071

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染人體后可引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[1]，該病毒傳播途徑多樣，潛伏期長且人群普遍易感[2]。國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》[3]，首次將抗體檢測結果作為血清學證據，納入COVID-19確診指標；同時，聯合兩次核酸檢測結果可作為疑似病例的排除標準。目前，檢測抗體的方法主要有膠體金法和化學發光法，檢測物質有總抗體(包括IgM、IgG、IgA等SARS-CoV-2的特異性抗體)、IgM、IgG。診療方案中提出可通過IgM和IgG的陰陽性或檢測值的變化進行診斷。由于膠體金法可快速檢測總抗體，縮短診斷窗口期，聯合核酸檢測，還能提升SARS-CoV-2檢出率，防止漏檢；同時，具有方便、快捷的優勢，在部分場合下可快速定位疑似人群、迅速隔離、防止傳播[4]。通過發病7 d后抗體血清學檢測結果，聯合兩次核酸檢測結果，提高排除疑似病例的準確性，合理節約醫療資源。本文通過對COVID-19人群、其他病原體感染人群的總抗體進行檢測，評估其臨床性能，為后續應用提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年2—3月在武漢雷神山COVID-19隔離觀察病房住院的患者血清標本共計89例(COVID-19組)，其中，男53例、女36例，年齡24～89歲、中位年齡67歲，40歲以上患者83例(93.2%)。非COVID-19患者88例(非COVID-19組)，其中男48例、女40例，年齡28～95歲、中位年齡65歲。非COVID-19組來自廣州金域醫學檢驗中心，SARS-CoV-2檢測結果均為陰性，其中肺炎衣原體IgM陽性4例、肺炎支原體IgM陽性14例、乙型流感病毒IgM陽性8例、副流感病毒IgM陽性6例、Q熱立克次體IgM陽性5例、嗜肺軍團菌IgM陽性1例、呼吸道腺病毒IgM陽性1例、呼吸道合胞病毒IgM陽性11例。COVID-19患者排除及納入均依據《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]，普通型、重型、危重型均按該方案分類，病程9～43 d，中位數26 d。

1.2儀器與試劑 核酸提取及檢測試劑盒購自長沙圣湘生物科技股份有限公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；總抗體檢測試劑盒購自廣州萬孚生物技術股份有限公司。

1.3方法 檢測COVID-19患者、非COVID-19人群總抗體，COVID-19患者入院時、抗體檢測時進行核酸檢測，非COVID-19人群檢測總抗體時行核酸檢測。經培訓合格的采樣人員采集所有研究對象鼻咽拭子，采集完成后冷藏送至武漢金域醫學檢驗所病毒診斷研究分中心實驗室，采用磁珠法提取核酸，實時熒光RT-PCR檢測核衣殼基因(N基因)和開放讀碼框1ab基因(ORF1ab基因)，按廠家說明報告結果。總抗體檢測：待測標本、試劑平衡至室溫后，向測試卡的加樣孔加入10 μL血清標本，再向測試卡的稀釋液加樣孔加入2～3滴標本稀釋液，15 min后判讀結果：檢測區和質控各出現一條紅線為陽性，僅在質控出現一條紅線為陰性，質控區無紅色線出現，檢測無效。

1.4評價指標 分析兩組患者的抗體結果。依據COVID-19患者臨床分型、發病時間進行分組，比較各組間抗體陽性率。根據入院核酸檢測結果和抗體檢測時同期核酸檢測結果分組，統計各組總抗體檢測結果的陽性率差異。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素的分析使用非條件Logistic回歸分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1COVID-19患者核酸檢測結果 89例COVID-19患者入院核酸檢測陽性35例(39.3%)，其中28例患者住院期間核酸檢測結果轉陰，7例患者住院期間核酸檢測結果持續陽性。

2.2兩組患者總抗體檢測情況 89例COVID-19患者中，77例總抗體檢測結果陽性，12例抗體檢測結果陰性；88例非COVID-19患者總抗體檢測結果均為陰性。8例COVID-19患者總抗體、核酸檢測均為陽性。12例總抗體檢測結果為陰性的COVID-19患者年齡24～85歲，中位年齡65歲，入院時采集核酸時以及采集總抗體時，核酸檢測均為陰性。男性患者總抗體陽性率為84.9%(45/53)，女性患者總抗體陽性率為88.9%(32/36)，不同性別間總抗體陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。未見8種呼吸道病原體與SARS-CoV-2總抗體的交叉反應。綜合以上檢測結果，總抗體檢測的靈敏度為86.5%(95%CI：0.793～0.938)，特異度為100.0%，陽性預測值為100%，陰性預測值為80.0%(95%CI：0.696～0.904)，約登指數為0.865。COVID-19患者和非COVID-19患者的總抗體陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3不同臨床分型的COVID-19患者總抗體陽性率的比較 COVID-19患者中普通型、重型和危重型患者分別有64例(71.9%)、19例(21.3%)、6例(6.8%)，總抗體檢測陽性的患者分別有57例(89.1%)、15例(78.9%)、5例(83.3%)，不同臨床分型的患者總抗體陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。發病時間為≤14 d、>14～28 d、>28 d的患者分別有10例(11.2%)、45例(50.6%)、34例(38.2%)。不同發病時間的患者總抗體陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。12例總抗體檢測陰性的COVID-19患者中普通型7例、重型4例、危重型1例。見表1。

表1 不同發病時間的普通型、重型、危重型患者總抗體陽性情況[n/n(%)]

2.4不同核酸檢測情況患者總抗體陽性情況 根據入院時和入院后核酸檢測結果，分為持續陽性組(入院時核酸檢測陽性，入院后核酸檢測陽性)、陰轉陽性組(入院時核酸檢測陰性，入院后核酸檢測陽性)、陽轉陰性組(入院時核酸檢測陽性，入院后核酸檢測陰性)、持續陰性組(入院時核酸檢測陰性，入院后核酸檢測陰性)。4組的總抗體陽性率分別為100.0%(7/7)、100.0%(28/28)、100.0%(1/1)、77.4%(41/53)。持續陰性組總抗體陽性率與其他組總抗體陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》發布之前，COVID-19及其疑似人群的確診和排除多采用RT-PCR檢測核酸或進行病毒基因測序，且把連續兩次核酸檢測陰性(至少間隔1 d)作為解除隔離和出院標準。由于病毒在采樣、送檢、試劑等方面的因素可能導致結果假陰性[5-6]，本文89例患者入院核酸檢測結果陽性率僅為60.7%。

目前經國家批準的用于檢測SARS-CoV-2抗體的方法主要有膠體金法和化學發光法。膠體金法相比于化學發光法檢測更為方便、快捷，不受檢測通量和采樣限制。

本研究納入的COVID-19患者臨床分型均為普通型及以上，發病到抗體檢測時間中位數為26 d，根據相關研究報道，COVID-19患者感染7 d后產生針對病毒的IgM抗體，約14 d產生IgG抗體[7-8]，故本文COVID-19組患者體內應以IgG為主。同時，本研究結果顯示，抗體檢測的總靈敏度和特異度與廠家聲明幾乎一致(廠家靈敏度為86.43%，95%CI：82.51%～89.58%；特異度為99.57%，95%CI：97.63%～99.92%)。

由于膠體金法受抗體結合位點、判讀方式所限，靈敏度不及化學發光法，李萍等[9]研究結果顯示，化學發光法檢測IgG和IgM的靈敏度分別為90.5%、75.9%，檢測IgG的靈敏度高于膠體金法。但本研究檢測的總抗體采用包含抗μ鏈抗體和抗人IgG抗體的二抗，其聯合檢測靈敏度高于單獨抗體檢測，可使處于不同潛伏期的患者以及體內存在不同抗體成分的人群得以檢出；另一方面，LI等[10]研究顯示，IgM抗體在生成2周左右開始衰減，若僅測定IgM抗體，有可能在低于檢測限后出現假陰性結果，這時IgG抗體大量分泌，通過抗體聯合檢測可有效降低假陰性率。另外，所有非COVID-19患者均未檢測出總抗體，特異性表現良好。基于以上特點，膠體金法測定SARS-CoV-2總抗體聯合核酸檢測可適用于社區診所、公司、學校、機場、海關等地快速定位疑似人群。

89例COVID-19患者中12例患者總抗體為陰性，且均存在持續陰性組中，持續陰性組抗體陽性率與其他組陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其他3組抗體陽性率均為100.0%。結合臨床資料，推測原因可能如下：(1)由于臨床治療及病程偏長，SARS-CoV-2的IgG抗體存在不同程度的降解并低于試劑檢出限；(2)12例患者中9例(75%)為65歲以上，免疫功能相對較低，或接受免疫抑制劑治療，抗體產生不足或抗體產生所需時間更長，低于試劑檢出限；(3)存在病毒其他分型或基因變異，導致抗體與試劑重組抗原的結合受到影響，以至兩個血清學檢測試劑及基因檢測試劑均未能檢出；(5)核酸檢測的假陰性。另外，本研究結果顯示，不同臨床分型和發病時間的患者其總抗體陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)，表明總抗體檢測結果與臨床分型和發病時間均無明顯相關性，提示治療過程中宜基于不同目的分別進行IgG和IgM的檢測。最后，基于抗原檢測特點，不同品牌試劑重組抗原選擇的蛋白靶點和片段、抗原表達及純化效果、整體工藝的差異可能會導致極少部分COVID-19患者結果的差異。另外，對多次核酸陰性、臨床癥狀明顯且總抗體陰性的患者，建議使用化學發光法檢測總抗體。

SARS-CoV-2總抗體檢測雖然也存在局限，但結合核酸檢測，有利于疫情的控制。文本的局限性在于COVID-19組均為普通型及以上，若增加輕型、SARS-CoV-2無癥狀感染者的評估，總抗體的檢測效能評估將會趨于完善。綜上所述，對COVID-19患者總抗體檢測方便快捷，且有助于疑似人群中感染者的快速定位，有利于疫情的控制。