HPLC-MS/MS檢測(cè)血液病患者體內(nèi)魯索替尼血藥濃度

王 磊，代玉超,王紅春，劉紅星,,4△

1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院病理和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河北廊坊 065201；2.山東省日照市東港區(qū)婦幼保健院麻醉科，山東日照 276800;3.北京陸道培醫(yī)院病理和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，北京 100176；4.北京陸道培血液病研究院，北京100176

魯索替尼是一種選擇性酪氨酸激酶-Janus激酶(JAK)抑制劑[1-3]，可以結(jié)合到JAK1和JAK2激酶上，抑制JAK1和JAK2信號(hào)，進(jìn)而下調(diào)JAK1介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)JAK2相關(guān)促紅細(xì)胞生成及免疫細(xì)胞活化功能，還可抑制Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)通路，從而調(diào)整下游細(xì)胞的增殖作用，用于骨髓纖維化患者的治療。魯索替尼亦可以抑制T細(xì)胞分泌炎癥因子、增加受者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而介導(dǎo)免疫耐受，還可以減少T細(xì)胞表面相關(guān)趨化因子或趨化因子受體進(jìn)而改變T細(xì)胞遷移，是治療移植物抗宿主病(GVHD)的二線用藥，具有顯著的療效，同時(shí)保留移植物抗白血病效應(yīng)[1-6]。魯索替尼是一種高效、選擇性強(qiáng)的小分子藥物，其口服后吸收快，1～2 h達(dá)血藥濃度峰值，在5～200 mg內(nèi)，血藥濃度和曲線下面積(AUC)隨劑量增加而升高，呈線性關(guān)系，達(dá)穩(wěn)態(tài)后，其血漿蛋白結(jié)合率約為97%[7-8]；主要經(jīng)肝臟CYP3A4酶代謝，代謝物大部分從尿液排出，其消除半衰期約為3 h[4-6]；起始劑量是根據(jù)患者的血小板計(jì)數(shù)來確定的，并通常根據(jù)血小板計(jì)數(shù)來調(diào)整劑量。但魯索替尼藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，且該藥與強(qiáng)CYP3A4酶抑制劑或強(qiáng)CYP3A4酶誘導(dǎo)劑合用，其暴露量會(huì)明顯增加(AUC增加91%)或減少(AUC減少71%)[4-5]，劑量增加會(huì)伴隨骨髓抑制增加，包括白細(xì)胞減少、貧血和血小板計(jì)數(shù)減低，且亦可發(fā)生急性耐藥[1-6]，且仍有一部分患者出現(xiàn)療效不佳或治療失敗，除考慮依從性、藥物間相互作用等可能的原因之外，還應(yīng)考慮標(biāo)準(zhǔn)劑量是否為該部分患者的最佳治療劑量，是否實(shí)現(xiàn)了魯索替尼治療效益最大化，則需要通過檢測(cè)藥物濃度來判斷患者體內(nèi)真實(shí)的魯索替尼濃度。目前，基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)定量檢測(cè)魯索替尼在血漿中濃度的研究較少，且大多采用固相萃取法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)藥物的濃度[4-9]，前處理復(fù)雜，且耗時(shí)較長，不適合于本實(shí)驗(yàn)室魯索替尼單藥的臨床檢測(cè)。由于HPLC-MS/MS具有專屬性好、靈敏度高、試劑成本低等優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)室采用HPLC-MS/MS檢測(cè)血液病患者魯索替尼血藥濃度，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取4例血液病患者的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。患者均為男性，年齡分別為17、33、37、65歲，檢測(cè)患者血漿標(biāo)本中的魯索替尼濃度。

1.2儀器與試劑 Nexera Xp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，帶自動(dòng)進(jìn)樣器和加熱器的色譜儀；API 3200 MD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)，自帶AB質(zhì)譜工作站Analyst MD Version1.6.2(美國AB Sciex公司)。蒸餾水(廣州屈臣氏)；甲醇購自Fisher公司(HPLC-Grade)；甲酸和乙酸銨購自MREDA TECHNOLOGY INC(HPLC-Grade)；魯索替尼購自北京百靈威科技有限公司(LOT：LF70 P20)；魯索替尼-d9購自TRC公司(LOT：10-MMH-128-2)。

1.3方法

1.3.1儲(chǔ)備液制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品魯索替尼1.0 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，得到100 μg/mL魯索替尼母液，作為儲(chǔ)備液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笥眉状家来蜗♂寖?chǔ)備液，得到魯索替尼濃度為25、50、100、250、500、1 000和2 500 ng/mL各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液和7.5、25.0、200.0 ng/mL的各系列質(zhì)控工作液。魯索替尼-d9亦依次經(jīng)過稱量、溶解、稀釋等操作，最終配置成濃度為25 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，作為含有內(nèi)標(biāo)的沉淀劑使用。

1.3.2樣品制備 將待測(cè)EDTA-K2抗凝血3 500 r/min離心10 min后，取上層血漿100 μL，加入100 μL緩沖液(2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液)混勻，再加入300 μL魯索替尼-d9內(nèi)標(biāo)液，渦旋震蕩混勻1 min，13 000 r/min離心10 min。移取上清液170 μL置于進(jìn)樣小瓶，自動(dòng)進(jìn)樣3 μL。

1.3.3高效液相色譜條件的設(shè)置 采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)，柱溫65 ℃；流速：0.7 mL/min；流動(dòng)相：2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液(B)+0.1%甲酸甲醇溶液(A)，進(jìn)樣量3 μL；洗脫方式：梯度洗脫，其中0.01～0.80 min，A相濃度從60%降低至5%，保持1.6 min；0.8～2.6 min，A相濃度從5%升高至60%，保持0.9 min。

1.4質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI+)；離子噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；源內(nèi)氣體1壓力：50 psi；氣體2壓力：50 psi；簾氣：20 psi；碰撞氣(N2)壓力：Medium；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。用于定量分析的各種質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。同時(shí)對(duì)分析物的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行了交叉討論，并對(duì)IS的校準(zhǔn)曲線和工作溶液進(jìn)行了最高標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)。采用二次、1/X2、最小二乘回歸算法繪制了選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)與濃度的峰面積比(魯索替尼/魯索替尼-d9)[10]。魯索替尼和魯索替尼-d9的碎片離子質(zhì)譜圖分別見圖1A、1B，魯索替尼的色譜圖見圖1C。

表1 質(zhì)譜條件

注：A為魯索替尼的質(zhì)譜圖；B為魯索替尼-d9的質(zhì)譜圖；C為魯索替尼的色譜圖。

1.5性能確證

1.5.1選擇性 選擇不含分析物和內(nèi)標(biāo)的雙空白血漿標(biāo)本來反映系統(tǒng)的整體背景噪音，要求在預(yù)期的保留時(shí)間處背景噪音峰的峰面積低于分析物定量檢測(cè)下限(LLMI)峰面積的20%，并低于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%[11-13]。

1.5.2攜帶污染率 選取高、低濃度樣本，按照“1.4”的處理方法進(jìn)行處理，對(duì)不同的組合進(jìn)樣，高-低值轉(zhuǎn)換樣本均值與低-低值轉(zhuǎn)換樣本均值的差小于低-低值轉(zhuǎn)換樣本的3SD[13]。在分析高濃度的樣本之后立刻進(jìn)樣1份空白樣本，以評(píng)估殘留情況[10]。要求分析空白樣本時(shí)的檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)值應(yīng)低于LLMI的25%[14-18]。

1.5.3基質(zhì)效應(yīng) 制備低、中、高(7.5、25.0、200.0 ng/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控品，測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)。通過將所提取的3個(gè)濃度的分析物和內(nèi)標(biāo)峰面積比與從純?nèi)芤褐苽浍@得的分析物和內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行比較來確定基質(zhì)效應(yīng)。按照“1.4”的處理方法對(duì)樣本進(jìn)行處理，在相同濃度下，低濃度質(zhì)控品下的峰面積比變異系數(shù)(CV)應(yīng)小于20%，中、高濃度質(zhì)控品下的峰面積比CV應(yīng)小于15%[13]。

1.5.4線性、分析測(cè)量范圍(AMR)、定量下限(LLOQ) 選取空白血漿90 μL 7份，分別加入濃度為25、50、100、250、500、1 000、2 500 ng/mL的魯索替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，加入100 mmoL/L緩沖鹽溶液100 μL，加入100 ng/mL魯索替尼-d9溶液300 μL，渦旋振蕩60 s，10 000 r/min離心10 min。吸取上清液于樣品管中，自動(dòng)進(jìn)樣3 μL。經(jīng)HPLC-MS/MS分析，以魯索替尼與內(nèi)標(biāo)魯索替尼-d9峰面積比(Y)作縱坐標(biāo)，以血漿魯索替尼濃度(X)為橫坐標(biāo)，得到直線方程，采用線性方程組計(jì)算所有樣品在分析范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)濃度。采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性擬合，做3批標(biāo)準(zhǔn)曲線，每天做1批，連續(xù)檢測(cè)3 d，記錄線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)，權(quán)重為1/X2，要求r≥0.990，LLMI處的偏差在±20%以內(nèi)，其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)，CV<20%，以平均信噪比(S/N)=10時(shí)的濃度方法確定LLOQ。

1.5.5精密度和正確度 取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控品，按照“1.4”的處理方法對(duì)樣本進(jìn)行處理，分別于不同分析批、批內(nèi)多次進(jìn)樣(n=5)，連續(xù)檢測(cè)3 d，計(jì)算其批內(nèi)和批間精密度和正確度。

1.5.6回收率 利用低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控品測(cè)定血漿回收率。將含有質(zhì)控濃度的所有分析物質(zhì)的血漿樣本也加入了各自的內(nèi)標(biāo)。按照“1.4”的處理方法對(duì)樣本進(jìn)行處理，將萃取后空白血漿標(biāo)本的峰值響應(yīng)與被甲醇∶水(50∶50，v/v)稀釋后的空白血漿制備的低、中、高質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣本的峰值響應(yīng)進(jìn)行比較，要求各濃度回收率在85%～115%，低濃度點(diǎn)在80%～120%，CV<15%。

1.5.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性采取評(píng)估臨床樣本的短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、進(jìn)樣器穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性考察質(zhì)控工作液樣本放置于室溫24 h的穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性考察樣本儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱30 d，進(jìn)樣器穩(wěn)定性是將樣本經(jīng)過前處理后加入進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)儲(chǔ)存24 h，凍融穩(wěn)定性是將樣本反復(fù)凍融3次進(jìn)行考察，通過測(cè)量穩(wěn)定樣本相對(duì)于新制備的相同濃度樣本相應(yīng)面積比響應(yīng)(魯索替尼/魯索替尼-d9)來評(píng)價(jià)血漿中的穩(wěn)定性結(jié)果。選取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣本，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了室溫6 h、4 ℃保存24 h、進(jìn)樣器24 h、-20 ℃保存48 h和-80 ℃反復(fù)凍融3次5個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。如果重復(fù)性測(cè)定的CV不超過15%，平均準(zhǔn)確度的CV在±15%以內(nèi)，則穩(wěn)定性可以接受。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。

2 結(jié) 果

2.1選擇性 不含分析物和內(nèi)標(biāo)的雙空白血漿標(biāo)本在保留時(shí)間處背景噪音峰的峰面積遠(yuǎn)低于分析物L(fēng)LMI峰面積的20%。

2.2攜帶污染率 魯索替尼在最低點(diǎn)和最高點(diǎn)的峰面積分別為1 500.00、147 000.00；魯索替尼-d9在最低點(diǎn)和最高點(diǎn)的峰面積分別為39 100.00、53 100.00。在進(jìn)樣線性最高點(diǎn)樣本后，立即進(jìn)樣空白樣本的峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于LLMI峰面積的20%，結(jié)果為0，無攜帶污染。

2.3基質(zhì)效應(yīng) 在相同的濃度下，低、中、高質(zhì)控品下的峰面積比的內(nèi)標(biāo)校正因子分別為1.02%、0.90%、0.95%，CV為2%～10%，小于15%，符合最終的準(zhǔn)確定量分析。見表2。

表2 測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)過程中低、中、高濃度質(zhì)控品下的峰面積比

2.4線性、AMR、LLOQ 結(jié)果顯示，魯索替尼血藥濃度在2.5～250.0 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.996 7)。當(dāng)S/N=10時(shí)，LLOQ為0.06 ng/mL。線性方程為Y=0.012X+0.009 49、Y=0.012X+0.004 58、Y=0.011 7X+0.001 66,相關(guān)系數(shù)r均≥0.995 0。

2.5精密度和正確度 對(duì)低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控品的標(biāo)本進(jìn)行精密度和正確度評(píng)估，批內(nèi)精密度分別為6.37%、3.81%和3.31%，批間精密度分別為4.25%、4.47%、2.68%，正確度均大于100%，見表3。

表3 精密度和正確度

2.6回收率 在低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控品的平均提取回收率分別為96.55%、110.32%和106.24%，回收率分別為84.2%～108.2%、97.5%～114.1%和99.2%～113.5%。見表4。

表4 測(cè)定回收率過程中低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控品下的峰面積比(n=5)

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 重復(fù)性測(cè)定的CV小于15%，平均準(zhǔn)確度的CV在±15%以內(nèi)，穩(wěn)定性可以接受，符合要求。見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)(%，n=3)

2.8臨床應(yīng)用 4例患者檢測(cè)結(jié)果見表6。可知，魯索替尼在不同疾病和不同患者中的血藥濃度與劑量不呈線性，差別較大。

表6 4例患者檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

魯索替尼作為骨髓增殖性疾病的一線用藥和白血病患者移植后GVHD的治療用藥，其同一用藥劑量下不同患者血藥濃度結(jié)果不同，治療效果亦不同，且易受CYP450酶的誘導(dǎo)劑和抑制劑影響，對(duì)魯索替尼進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。本文采用HPLC-MS/MS測(cè)定血漿魯索替尼濃度，通過對(duì)HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化，使得各項(xiàng)性能指標(biāo)符合行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[19-21]，達(dá)到專屬性較好且無殘留(結(jié)果為0)；基質(zhì)效應(yīng)為2%～10%，小于15%，滿足臨床試驗(yàn)的基本要求；線性較好(r=0.996 7>0.99)；批內(nèi)和批間精密度均較小，其重復(fù)性好(精密度2.0%～8.1%)，說明該方法較穩(wěn)定；低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控品的平均提取回收率分別為96.55%、110.32%和106.24%，說明試劑萃取效率高、完全，檢測(cè)結(jié)果正確度高，受相應(yīng)基質(zhì)干擾較小；對(duì)魯索替尼的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，除了低濃度質(zhì)控品(7.5 ng/mL)在-80 ℃反復(fù)凍融3次條件下的CV為14.78%(<15%)外，可能與人為操作有關(guān)，其余均<10%，說明魯索替尼受前處理方式和溫度及時(shí)間的影響較小；且魯索替尼物理化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，滿足臨床常規(guī)項(xiàng)目開展的要求。文獻(xiàn)[4-5]中建立的HPLC-MS/MS法，需要通過微柱或者針頭濾膜進(jìn)行過濾，且有時(shí)需要氮吹進(jìn)行富集，達(dá)到多種物質(zhì)響應(yīng)都較好的目的；且由于檢測(cè)多種物質(zhì)，其總分析時(shí)間較長，并且每種待測(cè)物質(zhì)不同時(shí)間都有自身的同位素內(nèi)標(biāo)。而本文前處理采用含有同位素內(nèi)標(biāo)的甲醇直接沉淀蛋白，操作簡(jiǎn)單，并且總分析時(shí)間為每針3.5 min，提高了工作效率，符合本院患者進(jìn)行魯索替尼血藥濃度測(cè)定的需要。由此可見，本實(shí)驗(yàn)室建立的用于魯索替尼濃度測(cè)定的HPLC-MS /MS法具有較高的靈敏度，適用于對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行定量檢測(cè)，能為臨床個(gè)體化用藥和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供參考。