CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒的性能驗(yàn)證*

李 婧，李林靜，劉 轉(zhuǎn)，楊文娟，馬青梅，張安安，楊海棠，劉欣躍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，甘肅蘭州 730030

華法林是使用最為廣泛的口服抗凝藥，也是治療心腦血管疾病的常用藥物，主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病，如心房顫動(dòng)、人工心臟瓣膜置換術(shù)后、腦梗死、深靜脈血栓等[1]。但華法林存在治療窗狹窄[2-3]、劑量差異大[4]、影響因素多[5]、反應(yīng)難預(yù)測[6-7]等特點(diǎn)，因此在使用過程中容易發(fā)生出血或栓塞等不良事件。目前最常用的華法林初始給藥法為基于經(jīng)驗(yàn)的固定劑量方案。隨著藥物基因組學(xué)研究的深入，遺傳因素與華法林劑量個(gè)體差異的關(guān)系已得到廣泛認(rèn)可[8-10]。2007年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)更改了華法林的說明書，在開始進(jìn)行華法林抗凝治療的患者中，有必要檢測細(xì)胞色素P450超家族第二亞家族C9代謝酶(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VKORC1)的基因型[11-12]。

根據(jù)ISO15189 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系對(duì)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目開展的要求，任何一個(gè)用于常規(guī)檢測的新系統(tǒng)或新項(xiàng)目在使用前必須進(jìn)行性能驗(yàn)證[13]，這是保證檢測質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)制定的有關(guān)要求，定性檢測項(xiàng)目的性能驗(yàn)證指標(biāo)宜包括符合率、檢出限、抗干擾能力等[14]。因此，本研究以該準(zhǔn)則為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步結(jié)合試劑說明書和本實(shí)驗(yàn)室的具體情況，制訂了一套驗(yàn)證方案從符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力4個(gè)方面對(duì)蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)進(jìn)行性能驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2017年10月至2018年5月因心房顫動(dòng)或心臟瓣膜病需行人工心臟瓣膜置換術(shù)且初次使用華法林，同時(shí)未使用其他溶栓藥物治療的患者20例，其中男9例、女11例，平均年齡(65.5±4.7)歲，所有患者無家族遺傳史，無血緣關(guān)系。

1.2儀器與試劑 核酸提取試劑盒(蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司)，人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法，蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI 7500)，核酸定量儀(美國Life公司Qubit3)。

1.3方法

1.3.1外周血DNA提取 采集所有患者靜脈血2～3 mL后EDTA-K2抗凝，4 ℃保存，采用柱提法提取DNA，DNA濃度均大于50 ng/μL、純度(A260 nm/A280 nm)為1.8～2.0，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光PCR擴(kuò)增 按照蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)的要求檢測CYP2C9基因c.1075位點(diǎn)(A/C)與人VKORC1基因-1639位點(diǎn)(G/A)核苷酸多態(tài)性，同時(shí)使用試劑盒自帶的質(zhì)控品做陰陽性對(duì)照。采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置FAM和VIC雙通道采集熒光信號(hào)。對(duì)于DNA樣本檢測反應(yīng)體系，其內(nèi)參擴(kuò)增曲線的Ct(VIC)值應(yīng)≤20，在內(nèi)參Ct(VIC)值正常的情況下，計(jì)算樣本檢測信號(hào)Ct(FAM)值與內(nèi)參信號(hào)Ct(VIC)值的差值，即ΔCt=Ct(FAM)-Ct(VIC)，根據(jù)ΔCt值判斷基因型。

1.3.3符合率驗(yàn)證 驗(yàn)證方案為使用蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒對(duì)上述已知20例基因型標(biāo)本進(jìn)行熒光PCR法檢測基因型，同時(shí)，將DNA標(biāo)本送至北京六合華大基因科技有限公司上海分公司進(jìn)行Sanger測序檢測基因型，然后比較兩種方法的符合情況，要求符合率≥95%為驗(yàn)證通過。

1.3.4精密度驗(yàn)證 包含批內(nèi)精密度和批間精密度驗(yàn)證，熒光PCR法檢測CYP2C9與VKORC1的基因分型精密度用每個(gè)通道檢測的Ct值的變異系數(shù)(CV)表示。要求CYP2C9 c.1075 A、CYP2C9 c.1075 C、VKORC1-1639 G，VKORC1-1639 A反應(yīng)體系FAM和VIC熒光通道的Ct值的CV均≤5%為驗(yàn)證通過。以下為驗(yàn)證方案：選擇1例已知基因型為雜合型的標(biāo)本(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA)，將該標(biāo)本在同一批次試驗(yàn)中連續(xù)測定5次。計(jì)算其均值(MEAN1)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD1)與變異系數(shù)(CV1)，為批內(nèi)精密度；將該標(biāo)本連續(xù)測定3 d，每批內(nèi)測定5次，共測定15次。計(jì)算其均值(MEAN2)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD2)與變異系數(shù)(CV2)，為批間精密度。

1.3.5檢出限驗(yàn)證 選擇2例雜合型標(biāo)本，基因型分別為CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA和CYP2C9 c.1075 AC、VKORC1-1639 GA，根據(jù)試劑盒說明書“參考品(雜合子)最低檢測下限低至10 ng/μL”，將這兩例標(biāo)本核酸濃度稀釋到10 ng/μL以下，上機(jī)檢測，重復(fù)5次，要求5次檢測基因型結(jié)果與未稀釋原濃度的基因型結(jié)果符合率達(dá)100%為驗(yàn)證通過。

1.3.6抗干擾能力驗(yàn)證 選擇1例已知基因型的血液標(biāo)本，基因型為CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 AA，分裝成10份標(biāo)本，每份200 μL，其中1份不添加任何干擾物質(zhì)，設(shè)為對(duì)照組；其余9份平均分為3組，每組分別加入3種干擾物質(zhì)，即血紅蛋白、膽紅素和膽固醇，每組重復(fù)檢測3次(終濃度為廠家申明的最高干擾濃度)，各試驗(yàn)組和對(duì)照組檢測結(jié)果的符合率≥90%表示抗干擾能力驗(yàn)證通過。

2 結(jié) 果

2.1符合率驗(yàn)證結(jié)果 20例標(biāo)本經(jīng)過熒光PCR和Sanger測序之后，顯示CYP2C9與VKORC1均有3種基因型，2種基因組合之后有4種基因型，兩種方法檢測的結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%，驗(yàn)證通過，見表1。

表1 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR和Sanger測序后符合率驗(yàn)證結(jié)果

續(xù)表1 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR和Sanger測序后符合率驗(yàn)證結(jié)果

2.2精密度驗(yàn)證結(jié)果 所選擇的雜合型標(biāo)本經(jīng)過5次批內(nèi)精密度檢測，結(jié)果顯示，CYP2C9兩個(gè)等位基因A和C的FAM和VIC熒光通道檢測CV1值分別為1.14%、1.60%、4.69%和0.58%，均小于5%；VKORC1兩個(gè)等位基因G和A的FAM和VIC熒光通道檢測CV1值分別為2.27%、1.26%、1.67%和1.50%，均小于5%；該雜合型標(biāo)本連續(xù)測定3 d，每批重復(fù)測定5次，合計(jì)15次重復(fù)檢測的批間精密度結(jié)果顯示，CYP2C9兩個(gè)等位基因A和C的FAM和VIC熒光通道檢測CV2值分別為0.85%、0.73%、2.94%和0.48%；VKORC1兩個(gè)等位基因G和A的FAM和VIC熒光通道檢測CV2值分別為2.48%、1.66%、3.56%和3.47%；以上4組CV值均小于5%，批內(nèi)和批間精密度驗(yàn)證均符合要求，見表2、3。

表2 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR測定批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果

表3 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR測定批間精密度驗(yàn)證結(jié)果

續(xù)表3 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR測定批間精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3檢出限驗(yàn)證結(jié)果 所選擇的2例雜合型標(biāo)本濃度均大于50 ng/μL，經(jīng)過稀釋后，2例標(biāo)本的DNA濃度均稀釋到小于10 ng/μL，分別為9.56 ng/μL和9.44 ng/μL，重復(fù)檢測5次后得到的基因型與未稀釋原濃度的基因型完全符合，驗(yàn)證通過，見表4。

表4 CYP2C9和VKORC1經(jīng)熒光PCR測定檢出限驗(yàn)證結(jié)果

2.4抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果 1份已知基因型(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 AA)的臨床標(biāo)本加入3種干擾物質(zhì)，配制血紅蛋白終濃度為20 g/L，總膽紅素終濃度為60 μmol/L、總膽固醇終濃度為10.1 mmol/L，結(jié)果表明加入血紅蛋白、膽紅素和膽固醇之后標(biāo)本的基因型與對(duì)照組基因型完全符合，符合率為100%，驗(yàn)證通過，見表5。

表5 CYP2C9和VKORC1熒光定量PCR抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

CYP2C9參與抗凝血藥華法林的羥化代謝，它的基因多態(tài)性可影響華法林在體內(nèi)的藥物濃度。CYP2C9*3(A1075C)是亞洲人群中最主要的基因多態(tài)性，中國人群中CYPC2C9*3的分布頻率約為4%[15]。維生素K氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點(diǎn)，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1的編碼基因VKORC1-1639 G>A的單核苷酸多態(tài)性可通過影響VKORC1表達(dá)，從而影響華法林的敏感性。VKORC1-1639A等位基因頻率在中國人群中高達(dá)90%[16]。所以本研究在標(biāo)本選擇上盡可能多的包含了中國人群中出現(xiàn)的各種基因型。

符合率驗(yàn)證試驗(yàn)中，兩種檢測方法共檢測出CYP2C9基因18例純合野生，1例雜合突變，1例純合突變；VKORC1基因1例純合野生，8例雜合突變，11例純合突變；以上兩種基因組合之后共檢測出4種基因型組合。熒光PCR檢測結(jié)果與基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”Sanger測序結(jié)果完全一致，表明該試劑盒符合率符合要求。

精密度檢測驗(yàn)證試驗(yàn)中，包含了批內(nèi)精密度和批間精密度的驗(yàn)證。雜合型標(biāo)本(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA)在批內(nèi)同時(shí)檢測5次后，其CV值均小于5%；同一標(biāo)本每批測定5次，連續(xù)3 d共測定15次的批間精密度結(jié)果顯示，其CV值均小于5%，表明該試劑盒精密度驗(yàn)證符合要求。

檢出限指可以準(zhǔn)確判斷基因型的最低基因組DNA濃度。本試劑盒說明書中判定10 ng/μL為最低檢出限，因此，本研究將基因組DNA稀釋至10 ng/μL以下進(jìn)行檢測，結(jié)果表明稀釋后的基因組DNA的熒光PCR檢測結(jié)果與稀釋前結(jié)果完全一致，表明該試劑盒最低檢出限驗(yàn)證符合要求。

抗干擾能力是指臨床標(biāo)本中的溶血、黃疸和脂血現(xiàn)象對(duì)檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響的能力。血液標(biāo)本的血紅蛋白、總膽紅素和總膽固醇的濃度根據(jù)廠家申明的最高干擾濃度配制，加入3種干擾物質(zhì)的基因分型結(jié)果與不加任何干擾物質(zhì)的對(duì)照組基因分型結(jié)果完全一致，表明試劑盒抗干擾能力良好。

綜上所述，蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)的符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力驗(yàn)證均符合ISO15189的要求，以上驗(yàn)證已經(jīng)可以在保證項(xiàng)目驗(yàn)收的基礎(chǔ)上，為臨床提供可靠的檢測結(jié)果，更好地為患者服務(wù)。如果條件允許，還可以在性能驗(yàn)證中使用其他無關(guān)位點(diǎn)突變的標(biāo)本或質(zhì)控品進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，進(jìn)一步完善性能驗(yàn)證結(jié)果。