新城疫病毒通過影響細胞微絲骨架對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

金燕，王靜，龐淼，張曉雪，劉開揚

宮頸癌是許多發展中國家的女性患癌死亡的常見原因，也是全球女性中最常見的惡性腫瘤［1］。溶瘤病毒（oncology virus，OVs）療法是一種相對安全有效的治療方法，可以在惡性腫瘤細胞中選擇性復制而不損害正常細胞［2］。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）則是天然溶瘤病毒的成員之一，屬于Avulavirus屬，副黏病毒科，可以用于癌癥的治療［3］。細胞骨架是維持真核細胞基本形態的重要結構，可承受細胞外界壓力以及保持細胞內部結構的有序性［4］。NDV在腫瘤細胞中識別、感染、釋放等過程均會對細胞骨架結構造成損傷［5］。研究發現，細胞骨架重塑可導致微絲及中間絲迅速解聚，使微管結構重組，形成凋亡微管網，凋亡微管網與微絲共同包裹細胞器進而形成凋亡小體［6-7］。NDV是否以細胞微絲骨架為靶點，通過各種途徑影響細胞的增殖、遷移與侵襲尚不明確。為此，本實驗用NDV F3株感染宮頸癌HeLa細胞，探究NDV抗腫瘤與細胞微絲骨架的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料宮頸癌HeLa細胞及NDV F3株由生命科學中心P2實驗室保存。DMEM基礎培養基、胰酶及細胞松弛素D（Cytochalasin D）購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海ExCellBio公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Matrigel膠購自美國BD公司；GAPDH抗體購自武漢ABclonal公司；RhoA、Rho激酶（ROCK）2、F-肌動蛋白（F-actin）抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京博奧森公司；Transwell3422購自美國康寧公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒和Hoechst33258購自上海碧云天生物技術有限公司；考馬斯亮藍-R250購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細胞培養用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的MEM培養基在37℃、體積分數5%CO2、飽和溫度條件下常規培養。NDV F3原液感染復數（multiplicity of infection，MOI）為100，用DMEM無血清培養基稀釋NDV F3，MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001。用NDV F3（終濃度MOI=0.1）分別作用細胞12、24和36 h，然后普通倒置顯微鏡下觀察細胞形態改變。

1.2.2 HeLa細胞微絲骨架染色考馬斯亮藍染色用于骨架形態及完整性研究，TritonX-100可以溶解脂膜大部分非骨架蛋白，細胞骨架系統的蛋白不被溶解，考馬斯亮藍染液進行染色，即可顯示骨架結構。選取生長狀態良好的HeLa細胞，消化為細胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養箱中繼續培養細胞融合至30%。每孔加1%Tritonx-100并沒過玻片，37℃靜置18 min，用M緩沖液洗3次，每次3 min；用戊二醛固定20 min，PBS洗3次；考馬斯亮藍R-250染液染色30 min，PBS洗3次。設置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實驗均重復3次，倒置顯微鏡下觀察NDV F3感染細胞后的形態變化及微絲骨架結構變化并攝片。

1.2.3 CCK-8法檢測HeLa細胞的增殖情況選取對數生長期的HeLa細胞，胰蛋白酶消化為細胞懸液，接種于96孔板中，CO2培養箱中繼續培養細胞融合至70%～80%。細胞培養至12、24、36、48、60和72 h后每孔各加入10μL CCK-8，CO2培養箱中孵育4 h。酶標儀于450 nm波長下測定各孔光密度（OD）值。設置對照組；病毒組MOI分別為1、0.1、0.01、0.01、0.001的NDV F3。增殖率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。以上實驗均重復3次。

1.2.4 Hoechst33258染色檢測HeLa細胞凋亡情況選取對數生長期的HeLa細胞，胰酶消化為細胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養箱中培養至細胞融合至70%～80%。培養24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次3 min。加入Hoechst33258染液染色8 min，PBS洗3洗，每次3 min。抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡攝片。設置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實驗均重復3次。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡將細胞接種于24孔板中，CO2培養箱中培養至細胞融合至70%～80%。用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100室溫孵育30 min，然后0.3%H2O2室溫孵育20 min。根據試劑盒說明書配置生物素標記液，每孔50μL生物素標記液37℃避光孵育60 min，然后每孔加200μL標記反應終止液室溫孵育10 min。配置Streptavidin-HRP工作液及DAB顯色液，每孔加50μL Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，然后每孔加200μL DAB顯色液室溫孵育15 min，PBS洗3次。顯微鏡下觀察攝片。設置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實驗均重復3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測HeLa細胞遷移能力選取對數生長期的HeLa細胞，胰蛋白酶消化為細胞懸液，接種于6孔板中，CO2培養箱中繼續培養細胞融合至90%。用10μL移液器在每孔中各劃3條水平的直線，PBS洗去劃掉的漂浮細胞，在劃痕0、24、48 h后倒置顯微鏡下觀察攝片并測量劃痕寬度。設置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D。細胞遷移率（%）=24 h或48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度×100%。以上實驗均重復3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測HeLa細胞侵襲能力將Matrigel膠置于4℃冰箱中使其變為液態，用無血清DMEM培養基稀釋（1∶3），每孔60μL Matrigel膠均勻地加入預冷的Transwell板，37℃放置1 h使其凝固；HeLa細胞先用無血清DMEM培養基饑餓12 h，胰酶消化并離心，PBS洗3次，細胞計數為（1～5）×107個/L，每孔200μL細胞懸液接種于上室孔中，下室加入500μL DMEM完全培養基。置于CO2培養箱中培養24 h；吸棄小室內培養基，用棉簽將Matrigel膠輕輕擦拭，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗3次；風干，置于倒置顯微鏡下觀察攝片。設置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實驗均重復3次。

1.2.8 Western blot分析細胞骨架相關蛋白F-actin、RhoA和ROCK2的表達收集NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用時間分別為24、36和48 h的細胞及對照組的正常細胞，并提取蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗4℃室孵育過夜；二抗在室溫孵育2 h。GAPDH作為內參。DAB顯色液顯色，AI600上機檢測條帶，用Image J分析并計算灰度值。以上實驗均重復3次。

1.3 統計學方法 本實驗數據均使用SPSS 26.0軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDV F3對HeLa細胞形態的影響倒置顯微鏡下觀察，對照組HeLa細胞貼壁良好，形態正常，呈鋪路石狀，折光性佳；NDV F3感染12 h后，細胞失去正常形態，邊緣逐漸模糊，胞漿內出現顆粒，部分細胞有融合現象；感染24 h后，細胞變圓并脫落，細胞破裂，并可見一些圓形空泡；感染36 h后，貼壁細胞剩余較少，大量細胞碎裂、懸浮，失去折光性。見圖1。

Fig.1 Observation of the morphology of HeLa cells infected by NDV under an ordinary inverted microscope(×100)圖1 普通倒置顯微鏡下觀察NDV感染HeLa細胞后形態（×100）

2.2 HeLa細胞微絲骨架染色NDV F3對細胞微絲骨架有極大的破壞作用。對照組的正常細胞微絲骨架無聚集且均勻排列，細胞表面結構正常。病毒感染后可引起細胞骨架重組，微絲骨架有聚合的現象，呈小團塊聚集，形成網絡空洞狀態，并且細胞的邊界更加明顯。Cytochalasin D作用后，可見微絲骨架排列紊亂，聚集成團，見圖2。

Fig.2 Observation of the microfilament skeleton of HeLa cells under an ordinary inverted microscope(Coomassie Brilliant Blue Staining,×200)圖2 普通倒置顯微鏡下觀察HeLa細胞微絲骨架（考馬斯亮藍染色，×200）

2.3 HeLa細胞的增殖情況CCK-8結果顯示，不同濃度的NDV F3對HeLa細胞增殖均有抑制作用，病毒濃度越大對細胞增殖作用抑制的越明顯（P＜0.05），在NDV F3終濃度為MOI=1和MOI=0.1時抑制效果較明顯；NDV F3作用不同時間之間的差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 HeLa細胞凋亡情況Hoechst33258染色結果顯示，對照組細胞核形態及大小較均一，邊界完整清晰，熒光染色呈勻質狀。與對照組相比，NDV F3感染后的HeLa細胞可見細胞核聚集固縮，部分細胞核呈碎塊狀，形成凋亡小體，為細胞凋亡的特征性改變。熒光染色呈高亮。見圖3。TUNEL檢測結果顯示，對照組的正常細胞未被DAB染成棕色，為陰性，NDV F3組細胞凝集成團的部分與DAB結合顯示為棕色，細胞發生凋亡，并且MOI=0.1時凋亡發生結果更為顯著。見圖4。

2.5 HeLa細胞遷移能力細胞劃痕實驗結果顯示NFV F3對細胞的遷移能力有抑制作用。與對照組相比，NDV F3終濃度MOI=0.1作用24 h和48 h時對細胞遷移能力均有抑制作用，并且病毒作用48 h的抑制效果較24 h更加顯著。Cytochalasin D組與對照組相比也有明顯的抑制作用，隨著作用時間的增加，抑制效果更加顯著。見圖5、表2。

Tab.1 Effects of different groups and different duration time on the proliferation of HeLa cells表1 不同分組及不同作用時間對HeLa細胞增殖的影響

表2各組在劃痕24 h和48 h的遷移率比較Tab.2 The mobility of different groups at 24 h and 48 h after scratch

Fig.3 The effect of NDV F3 on HeLa cell apoptosis(Hoechst33258 Staining,×100)圖3 NDV F3對HeLa細胞凋亡的影響（Hoechst33258染色，×100）

Fig.4 NDV F3 induced apoptosis of HeLa cells(DAB Staining,×100)圖4 NDV F3誘導HeLa細胞發生凋亡（DAB染色，×100）

2.6 HeLa細胞侵襲能力Transwell實驗結果顯示NFV F3對細胞的侵襲能力有抑制作用。與對照組［（548.333±26.951）個/視 野］相 比，NDV F3組［（61.333±23.159）個/視 野］和Cytochalasin D組［（238.667±32.808）個/視野］穿過小室的數目均明顯減少（n=3，F=233.760，P＜0.01）。見圖6。

2.7 NDV F3對HeLa細胞骨架相關蛋白F-actin、RhoA和ROCK2表達的影響Western blot結果顯示，在NDV F3作用HeLa細胞24 h時，F-actin、RhoA和ROCK2表達量較對照組均無明顯差異，而36 h和48 h時3種蛋白的表達量均較對照組降低（P＜0.01）。見圖7、表3。

Tab.3 Comparison of expression levels of cytoskeletonrelated proteins F-actin,RhoA and ROCK2 between four groups表3 各組間F-actin、RhoA、ROCK2蛋白表達量比較

3 討論

3.1 NDV治療腫瘤的潛力溶瘤病毒的應用是具有潛力的癌癥治療策略。溶瘤病毒可分為基因工程或天然存在的毒株，其通過選擇性感染癌細胞而不損害未轉化的細胞和正常組織，從而誘導有效的適應性抗腫瘤免疫［8-9］。截至目前，溶瘤病毒Onyx-015（中國）和T-VEC（美國）分別被批準用于頭頸部鱗狀細胞癌［10］和轉移性黑素瘤［11］受試者。除此之外，許多其他溶瘤病毒已用于臨床前研究和早期臨床試驗。臨床試驗表明在各種類型實體瘤的癌癥患者中使用野生型NDV毒株進行抗腫瘤治療未見嚴重的不良反應［12］。因此，溶瘤性NDV用于癌癥治療可能是一種安全有效的策略。

3.2 NDV F3可通過微絲骨架影響腫瘤細胞的增殖倒置光學顯微鏡下觀察NDV感染后的HeLa細胞有明顯的融合現象，隨著感染時間的延長，細胞不再貼壁生長并且大量漂浮死亡。CCK-8實驗和Hoechst33258染色確定NDV感染細胞后的細胞活性受抑，NDV感染后可以使細胞膜受損，釋放乳酸脫氫酶，抑制了細胞增殖，并且細胞核發生了固縮、碎裂以及形成凋亡小體，細胞發生凋亡。進一步用TUNEL檢測法特異性地觀察到凝集的細胞團可以被DAB特異性結合，顯示為棕色，證明細胞發生凋亡。以上實驗結果均證明NDV F3感染能抑制HeLa細胞增殖并誘導其凋亡。Cytochalasin D是一種源于真菌代謝產物的肌動蛋白聚合抑制劑，通過與肌動蛋白纖維正端的結合來抑制亞基的聚合和解離，從而干擾細胞的運動、生長及吞噬等多種細胞生理過程。細胞骨架由微管、微絲、中間絲構成。微絲由Actin和與其結合的蛋白組成。細胞的運動、分裂、質膜的流動等多種功能都需要Actin的協調流動和重建［13］。本研究以Cytochalasin D作為細胞骨架異常的陽性對照，通過對細胞微絲骨架的染色發現NDV F3作用HeLa細胞后細胞微絲骨架發生聚集現象且排列紊亂。Rho家族蛋白是Actin的上游調控因子。研究顯示，Rho家族蛋白具有促進腫瘤細胞增殖并抑制凋亡的作用，對腫瘤的發生發展起著促進作用［14］。細胞發生凋亡時，細胞骨架內的結構會發生變化，細胞骨架重組，形成凋亡微管網及凋亡小體［15］。

3.3 NDV F3可通過微絲骨架影響腫瘤細胞的遷移與侵襲惡性腫瘤致死率高主要是因為腫瘤細胞具備了遷移和侵襲的能力，能夠穿透基底膜并到達間質，完成上皮間質轉化（EMT）這一癌變過程，然后隨著血液和淋巴轉移［16］。細胞骨架與腫瘤的遷移與侵襲密切相關［5］。RhoA/ROCK信號通路是參與微絲骨架改變的一條重要通路。RhoA不僅與腫瘤細胞的增殖有關，還可以通過與GTP酶結合活化下游效應蛋白調節細胞骨架，從而影響細胞遷移［17］。ROCK是RhoA蛋白重要的下游效應器，通過磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌球蛋白磷酸酶亞基1（MYPT1），影響肌動蛋白與肌球蛋白的交聯以及肌動蛋白微絲骨架的聚合，進一步調控細胞骨架微絲和偽足等Factin樣結構形態改變，導致微絲骨架重組等多種生物學行為［18-19］。本研究中，劃痕和Transwell實驗發現NDV F3對HeLa細胞的遷移率和侵襲數目均有抑制作用，Western blot檢測F-acin、RhoA和ROCK的蛋白表達量均有降低的趨勢，提示NDV的作用可能破壞了細胞骨架內的結構，影響微絲骨架的聚合，從而破壞了細胞的遷移及侵襲能力。其機制可能與RhoA/ROCK信號通路有關。

綜上所述，NDV F3可抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖并誘導凋亡，其機制可能與破壞細胞微絲骨架等結構的完整性與功能有關。此外，NDV F3作用HeLa細胞后對細胞的遷移與侵襲能力均有抑制作用，其機制可能與細胞微絲骨架蛋白相關的RhoA/ROCK信號通路有關。

Fig.5 Changes in migration distance of each group of cells after scratching(×100)圖5 各組細胞劃痕后遷移距離的變化（×100）