HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表達及其對預后的意義

焦健華，焦 點，張景良，彭詩元，秦 軍，楊力軍，王映梅，馬帥軍，武 鵬，荊玉明，秦衛軍

(中國人民解放軍空軍軍醫大學：1.西京醫院泌尿外科，陜西西安 710032；2.唐都醫院泌尿外科，陜西西安 710038;3.西京醫院病理科,陜西西安 710032)

根據2018年全球癌癥統計分析顯示，全球每年有約55萬新發膀胱癌患者，約20萬患者死于膀胱癌[1]。其中男性發病率約為女性發病率的4倍，膀胱癌在男性新發惡性腫瘤中位居第6位，死亡率位于第9位[1]。膀胱尿路上皮癌(urothelial carcinoma of bladder，UCB)是最常見的膀胱癌類型，約占膀胱癌病例90.0%以上[2]。經尿道膀胱腫瘤切除術(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)是膀胱癌的主要治療手段[2]。目前患者的預后預測主要依靠腫瘤的數量、大小、分級、分期等臨床病理因素，尚缺少有效預后標志物對患者進行預后分析。

高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)由HMGB1基因(13q12)編輯，是一種相對保守的非組蛋白染色體蛋白[3]。目前有研究表明，與正常組織相比，HMGB1在舌鱗狀上皮癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、胃癌、腦膠質瘤等多種惡性腫瘤中表達顯著增加[3-8]。由于在惡性腫瘤發生發展、新生血管形成、腫瘤免疫耐受等方面具有重要作用，近年來HMGB1成為惡性腫瘤研究的熱點之一。本研究通過探討HMGB1在UCB患者中表達情況，分析其與患者臨床病理資料之間的聯系，并探究其對預測UCB患者預后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2007年6月至2015年6月在空軍軍醫大學西京醫院泌尿外科經手術切除并診斷為UCB的98例患者的臨床病例資料，所有患者均有完善的臨床資料、隨訪資料和保存完整的UCB組織蠟塊標本。其中男性83例，女性15例；年齡26～86歲，平均(64±12)歲。根據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)膀胱癌TNM臨床分期系統(2017版)顯示：Ⅰ期49例，Ⅱ期23例，Ⅲ期24例，Ⅳ期2例。所有組織樣本均采用4.0%中性緩沖甲醛固定液固定并進行常規石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1主要試劑 兔抗人單克隆抗體HMGB1(工作濃度1∶1 000，英國Abcam公司)；免疫組織化學檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司；小鼠抗人單克隆抗體Ki-67(工作濃度，即用型，福州邁新公司)。

1.2.2HE染色 所有組織蠟塊切片后進行常規HE染色，石蠟切片厚度為4 μm。常規脫蠟水化，蘇木素染色5 min，自來水清洗2 min，1.0%鹽酸乙醇(體積分數)分化5 s，0.5%稀氨水(體積分數)反藍5 s，伊紅染色1 min，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明后使用中性樹膠封片，在顯微鏡下由2名泌尿生殖病理專家進行觀察及病理診斷。

1.2.3免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色 將石蠟切片進行常規脫蠟水化后，與煮沸的檸檬酸鹽抗原修復液中加熱修復2 min，自然冷卻后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗5 min×3次，內源性過氧化物酶阻斷劑(SP KIT-A3，福州邁新) 孵育30 min，PBS洗5 min×3次，正常非免疫山羊血清(SP KIT-B3，福州邁新)孵育60 min，HMGB1抗體按1∶1 000(體積分數)4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次，加入酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(SP KIT-5030，福州邁新)孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色(UltraDAB-4033，福州邁新)3 min，蘇木素染核5 min，鹽酸乙醇分化后使用稀氨水反藍，并常規脫水透明后，中性樹膠封片。每組IHC染色均設置陽性對照和陰性對照進行質量控制。

1.2.4染色判斷標準 免疫組織化學染色的判斷采用半定量方法進行。如圖1所示，HMGB1的染色大多位于細胞核：根據細胞核染色細胞的比例對免疫組織化學評價，將細胞核染色陽性細胞比例>50.0%列為HMGB1高表達組，≤50.0%列為HMGB1低表達組。在計算染色細胞比例時，采用Image J軟件輔助計算染色細胞比例并由2名具有10年以上泌尿生殖病理診斷經驗的病理科專家進行評價。為進行生存分析比較，本研究將全部樣本人群分成HMGB1高表達人群(細胞核染色陽性細胞比例>50.0%)和HMGB1低表達人群(細胞核染色陽性細胞比例≤50.0%)。

1.3 統計學分析采用SPSS 23.0統計軟件，使用χ2檢驗進行率的比較，使用Kaplan-Meier曲線對HMGB1高表達和HMGB1低表達兩組人群進行生存分析，對可能影響預后的因素進行單因素分析和多因素分析，使用Cox回歸分析相應95.0%置信區間危險比，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 UCB患者的基本資料98例患者的性別及腫瘤分級、分期等具體情況見表1。

2.2 UCB中HMGB1的表達及與患者臨床病例特點的關系本研究通過對98例膀胱尿路上皮癌樣本進行IHC檢測，發現其中49例為HMGB1低表達(細胞核染色陽性細胞比例≤50.0%)，49例為HMGB1高表達(細胞核染色陽性細胞比例>50.0%)。如圖1所示，為不同HMGB1免疫組織化學染色陽性細胞比例的代表圖片。如表2所示，在98例患者中，不同N分期UCB患者的HMGB1表達比例之間存在顯著性統計學差異(P<0.01)；不同年齡、性別、腫瘤分化程度、T分期、TNM分級及Ki-67增殖系數UCB患者的HMGB1表達比例之間無顯著性統計學差異(P>0.05)。

表1 UCB患者的臨床病理

A：HMGB1(0%細胞染色)；B：HMGB1(<50%細胞染色)；C：HMGB1(>50%細胞染色)；D：HMGB1(100%細胞染色)。

表2 HMGB1與UCB患者臨床病理的關系 [例(%)]

2.3 HMGB1不同表達比例分組患者的生存曲線分析經Kaplan-Meier生存函數分析，HMGB1不同表達比例分組的UCB患者生存率呈現較大差異，其中HMGB1高表達患者的總生存率均明顯低于HMGB1低表達患者，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)，這說明HMGB1高表達的UCB患者預后情況較差(圖2)。

2.4 影響UCB患者的預后因素的Cox回歸模型單因素和多因素分析Cox比例風險回歸模型統計單因素分析顯示(表3)，在UCB患者各種臨床病例因素中，HMGB1表達比例、腫瘤T分期、N分期、M分期、TNM分級、腫瘤分化程度、Ki-67細胞增殖系數均與預后有關(P<0.01)，而年齡、性別與預后無關(P>0.05)。HMGB1表達比例與UCB患者預后相關性密切(P<0.01)。Cox比例風險回歸模型統計多因素分析顯示，UCB患者的HMGB1表達比例與預后密切相關，是預測UCB患者預后的獨立預后因素。

圖2 HMGB1不同表達患者的Kaplan-Meier曲線

表3 UCB患者的Cox回歸分析

3 討 論

HMGB1作為一種高度保守的染色體蛋白，在腫瘤發生發展過程中通過調節免疫、基因組穩定性、細胞增殖、腫瘤轉移、凋亡等功能發揮重要作用[9-10]。研究表明，HMGB1在多種惡性腫瘤中表達顯著上調，且與患者預后密切相關[11-16]。HMGB1與UCB患者預后可能存在相關性，這為尋找膀胱癌患者的預后分子標志物提供了參考依據[17,18]。由于膀胱癌患者中大多為UCB患者，因此探究HMGB1在UCB患者中的表達情況及預測預后作用具有重要意義。

本研究采用IHC方法利用抗體對組織樣本中的HMGB1蛋白表達水平進行檢測。通過對98例UCB樣本的HMGB1檢測，我們發現HMGB1普遍表達于膀胱癌組織中，且與周圍正常組織相比，大多癌組織的HMGB1表達比例明顯較高。通過進一步對UCB組織的HMGB1表達水平進行IHC評分及分析發現，HMGB1高表達(細胞核染色陽性細胞比例>50.0%)UCB患者與HMGB1低表達(細胞核染色陽性細胞比例≤50.0%)UCB患者相比預后較差。既往有研究表明，HMGB1在膀胱癌中的高表達表現為mRNA和蛋白表達水平均明顯高于周圍正常組織[19]，且在浸潤性尿路上皮癌中表達比例明顯較高[17]。YANG GL等[18]通過對164例膀胱癌患者的研究表明，HMGB1過表達與膀胱癌的腫瘤T分期及分級相關，可能提示膀胱癌患者預后較差[18]。目前，在UCB患者中有關HMGB1的表達及與UCB患者預后關系的研究仍較少。

HMGB1導致UCB患者預后較差可能與HMGB1在腫瘤發生發展中的作用有關。有研究表明，HMGB1與腫瘤免疫逃逸關系密切：HMGB1是T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3，HAVCR2)的主要配體之一，在腫瘤相關樹突細胞中通過與TIM-3結合抑制DNA疫苗和化療的抗腫瘤作用[20]。除TIM-3外，HMGB1也激活其受體RAGE，從而導致NF-κB途徑激活，進而上調白細胞粘附分子，以促進炎癥及血管生成[21]。有研究表明，HMGB1高表達與惡性腫瘤進展及血管生成密切相關[22]，可促進內皮細胞增殖和體內新生血管形成[23]。而在敲除HMGB1后，膀胱尿路上皮癌細胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制，且對順鉑的敏感性增加[24]。目前也有研究表明，血清HMGB1水平與部分惡性腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤大小等因素有關[21]，有望用于預測接受索拉菲尼治療肝癌患者的預后[25]。以上研究表明組織及血清HMGB1均與多種惡性腫瘤的發生發展關系密切。

綜上所述，本研究采用IHC方法對UCB患者組織中的HMGB1表達水平進行研究，發現HMGB1高表達UCB患者預后較差。HMGB1是預測UCB患者預后的獨立預后因素，且有望成為評估UCB患者預后的重要分子標志物。