砷及MPST過表達對SH-SY5Y細胞GRP78/CHOP通路的影響

李 成，樓迪棟，齊曉嵐，范海瓊，朱 衛，潘際剛

(1.貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室，2.貴州中醫藥大學基礎醫學院，3.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種廣泛分布于環境中的環境毒物。砷常通過水、食物、空氣等途徑進入人體后引起人的器官或組織損傷[1]。研究表明，砷具有神經毒性作用，其可以通過血腦屏障直接造成人大腦皮質組織不可逆性損傷，從而引起人認知功能障礙，并造成學習、記憶能力的減弱[2-3]。因此，開展對于砷的神經毒性損傷及其作用機制的研究對于防治砷中毒具有重要現實意義。本課題組前期研究表明，亞砷酸鈉對SH-SY5Y神經細胞具有毒性作用，而外源性過表達MPST蛋白可以拮抗砷所致的神經毒性損傷[4]。而本研究以慢病毒轉染穩定表達外源MPST的SH-SY5Y細胞為觀察對象，檢測砷暴露前后GRP78和CHOP蛋白表達水平，進一步探討內質網應激通路是否參與砷神經損傷以及MPST過表達對砷誘導的內質網應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，購自德國DSMZ公司穩定感染慢病毒載體的人的SH-SY5Y細胞(SH-PEB細胞)穩定感染MPST重組慢病毒載體的SH-SY5Y細胞(SH-MPST細胞)

1.1.2試劑 胎牛血清(Gibco)，購自以色列BioInd公司(批號:10099141C)；青霉素-鏈霉素，購自美國Gibco公司(批號:15140163)；胰蛋白酶，購自美國Gibco公司(批號:25200056)；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自北京索萊寶公司(批號:P1032)；DMEM培養基，購自美國Hyclone公司(批號:SH30081)；NaAsO2，購自美國Sigma公司(批號:S7400)；葡萄糖調節蛋白78蛋白(glucose regulated p rotein，GRP78)抗體(批號:sc-166490)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗體(批號:sc-365318)、抗小鼠IgG-HRP二抗(批號:P1032)，購自美國Santa Cruz公司，牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)，購自購自美國Sigma公司(批號:sc-2005)。

1.1.3儀器 Model 310細胞恒溫CO2培養箱(美國Thermo公司)；細胞培養超凈臺(蘇州凈化)；全波段多功能酶標儀(BioTek公司)；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；全自動凝膠成像儀(美國SynGene)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 SH-SY5Y細胞培養在高糖DMEM培養基(含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中，隔天換液，細胞生長至70%匯合度時進行傳代或凍存。

1.2.2慢病毒轉染MPST過表達 本實驗所用細胞為前期已建立過表達細胞株[5]。通過PCR擴增出MPST目的基因，并將其克隆到慢病毒表達載體pEB-GFP(T2A)PURO上，然后將重組慢病毒表達載體和慢病毒包裝質粒系統(pLP/VSVG, pLP1, pLP2)共轉染293T細胞48 h后，收集病毒液。當SH-SY5Y細胞在12孔板生長至50%匯合度時進行轉染，細胞更換為含10 mg·L-1基因轉染增強劑聚凝胺(polybrene)及10% FBS的DMEM培養基，分別于不同孔加入1 mL含MPST和空載體的病毒液，分別設為過表達組和空載對照組，培養箱中繼續培養6 h后，更換含10% FBS的DMEM培養基繼續培養，細胞生長至90%匯合度以嘌呤霉素進行篩選，最終以蛋白印跡實驗驗證MPST表達水平。

1.2.3實驗分組 實驗分6組:MPST慢病毒轉染組(SH-MPST過表達組)，空載體轉染對照組(SH-PEB組)，染砷組(NaAsO2組)，TUDCA阻斷劑組，TUDCA預處理染砷組。

1.2.4蛋白印跡檢測 藥物處理細胞后，以RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)裂解細胞，冰上裂解10 min，20 627×g離心15 min，取上清液進行BCA蛋白定量，計算并配制上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，進行12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，用GRP78、CHOP抗體(1 ∶1 000)或內參抗體GAPDH(1 ∶ 2 000)于4 ℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，抗小鼠IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，PVDF膜以化學發光試劑盒進行顯色，凝膠成像儀成像，以Quantity One對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

2 結果

2.1MPST過表達對細胞GRP78與CHOP蛋白表達的影響如Fig 1所示，蛋白印跡實驗發現，未染砷處理的對照組和過表達組細胞內GRP78與CHOP蛋白表達無差異。

2.2 NaAsO2和TUDCA對SH-PEB細胞GRP78與CHOP蛋白表達的影響如Fig 2所示，蛋白印跡實驗發現，與未染砷處理的對照組細胞相比，50 μmol·L-1NaAsO2處理的對照組細胞中GRP78與CHOP蛋白明顯上調(P<0.01)；而預先加入1 mmol·L-1內質網應激阻斷劑TUDCA預處理可以逆轉砷誘導的GRP78與CHOP的上調現象(P<0.01)。

Fig 1 Effect of MPST overexpression on expression of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins n=3)

Fig 2 Effect of NaAsO2 and TUDCA on expressions of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins in SH-PEB cells

2.3 NaAsO2和TUDCA對SH-MPST細胞GRP78與CHOP蛋白表達的影響如Fig 3所示，蛋白印跡實驗發現，與未染砷處理的過表達組細胞相比，50 μmol·L-1NaAsO2處理的過表達組細胞中GRP78與CHOP蛋白明顯下調(P<0.01)；而預先加入1 mmol·L-1內質網應激阻斷劑TUDCA預處理使50 μmol·L-1NaAsO2處理的過表達組細胞中GRP78與CHOP蛋白上調(P<0.01)。

Fig 3 Effect of NaAsO2 and TUDCA on expressions of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins in SH-MPST

3 討論

內質網是一種重要的細胞器，參與并調節蛋白質的合成、折疊、修飾及運輸等生命活動。當細胞受到遺傳因素或者環境因素影響時，會使錯誤折疊的蛋白質在內質網中積聚，發生內質網應激。研究表明，內質網應激與神經退行性疾病、糖尿病、代謝綜合癥和癌癥的發生發展密切相關[6]。Sun等[7]通過建立大鼠飲用水染砷模型研究發現，慢性砷暴露處理后大鼠學習記憶能力明顯下降且伴隨著大鼠海馬細胞中GRP78 蛋白、PERK蛋白、ATF4蛋白、CHOP蛋白表達上調。在本實驗中，砷暴露處理后的SH-SY5Y細胞內的GRP78與CHOP蛋白表達也明顯上調，而給予內質網應激阻斷劑TUDCA預處理可以逆轉砷誘導的GRP78與CHOP蛋白上調現象。眾所皆知，GRP78與CHOP蛋白表達的變化是內質網應激的標志[8]。這些結果共同提示砷的神經毒性作用可能與砷誘導細胞發生內質網應激有關。

近年來，H2S作為一種新型氣體信號分子得到廣泛關注[9]。在哺乳動物體內，H2S由胱硫醚-γ-裂合酶、胱硫醚-β-合酶和3-巰基丙酮酸硫轉移酶(MPST)合成。H2S具有舒張血管、降血壓、抗凋亡、抗炎、參與抗氧化應激等多種生物學功能[10]。此外，Li等[11]研究發現，腹腔注射30或100 μmol·kg-1NaHS的生理鹽水可以改善由鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的心肌肥大，使用含NaHS的生理鹽水干預的大鼠心肌細胞中GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達降低，這說明H2S通過影響內質網應激發揮心臟保護作用。本課題組前期研究表明，亞砷酸鈉對 PC12 細胞的損傷作用與砷下調3MST蛋白的表達有關，外源性過表達MPST可以拮抗亞砷酸鈉的毒性損傷作用[4,12]。而本次實驗發現，過表達MPST可以逆轉砷誘導的GRP78與CHOP蛋白上調，而且使內質網應激水平明顯低于正常，這一結果提示外源性過表達MPST可以降低機體對砷刺激后一系列內質網應激反應。進一步使用內質網應激阻斷劑TUDCA進行預處理，MPST過表達對砷暴露下內質網應激超低水平的維持效應被逆轉。綜上所述，GRP78/CHOP內質網應激通路參與了砷誘導的神經毒性損傷；MPST過表達可降低砷誘導的內質網應激水平。然而砷是如何引起GRP78、CHOP蛋白表達的變化從而發揮損傷效應，過表達MPST又是如何在砷暴露下維持超低內質網應激水平，這些機制還有待進一步研究。