HMGB1/TLR4介導狼瘡性腎炎腎小球細胞增殖和細胞外基質沉積

高 璠，汪 鑫，楊 冉，田月新，苗心妍，封曉娟，劉淑霞

(1.河北醫科大學教學實驗中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學第二醫院泌尿外科,河北 石家莊 050000；3.河北省中醫院病理科,河北 石家莊 050000；4.河北醫科大學病理學教研室，河北 石家莊 050017)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統性紅斑狼瘡( systemic lupus erythematosus，SLE)的常見并發癥之一，發病率很高且治愈率很低，一直是SLE患者的主要死因之一，因此探明 LN的發病機制，以期為探索有效的LN治療靶點提供堅實的實驗理論依據尤為重要。在臨床上狼瘡性腎炎患者的病理呈現出多樣性，腎小球內皮細胞及系膜細胞的過度增殖，炎細胞浸潤，新月體形成等均是LN活動期主要病理改變及評分依據，細胞外基質沉積則是狼瘡性腎炎向終末期進展的主要原因之一，由細胞外基質沉積導致的多數腎小球發生硬化是LN腎臟病理損傷的終末階段及主要死因。因此，在本研究探討了LN腎小球細胞增殖和細胞外基質的發病機制。

細胞的增殖活性主要受細胞周期蛋白及其依賴性激酶調控，而在多種疾病中發現細胞因子是通過調控細胞周期蛋白及其依賴性激酶來介導細胞的增殖水平從而參與疾病發生的，我們前期實驗[1-2]已經證實，重組高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)蛋白能夠顯著上調人腎小球系膜細胞(human mesangial cell，HMC)的增殖水平，而通過質粒轉染技術抑制MRL/ lpr小鼠腎臟組織中HMGB1蛋白的表達則可部分減緩小鼠腎小球細胞數目的增多及系膜區的增寬。

系膜區增寬是腎小球硬化的形態學表現之一，腎小球硬化細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積則是其發生的病理學基礎，其主要過程可能是腎小球系膜區及毛細血管袢血管壁基底膜部位包括Ⅳ型膠原蛋白(typeⅣ collagen，collagenⅣ)、纖連蛋白(fibronectin，FN)、蛋白多糖、糖胺聚糖等膠原蛋白和非膠原糖蛋白合成增多或降解減少造成的。腎小球系膜細胞是參與ECM過度沉積的主要細胞。近年來的研究發現，HMGB1參與多種疾病的纖維化或硬化進程，那么HMGB1是否與LN的細胞外基質沉積相關，其機制如何？一旦被分泌至胞外，HMGB1大多情況下是作為DAMP與靶細胞細胞膜受體相互結合從而進一步激活靶細胞內下游的信號通路，以介導疾病的發生。Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)和RAGE是最早發現也是最常見的HMGB1相關受體，我們前期實驗已證實TLR2介導了HMGB1誘導的LN中細胞增殖，TLR4與HMGB1所誘導的系膜細胞增殖關系如何？HMGB1是否通過與TLR4結合介導LN的腎小球細胞外基質沉積？

綜上所述，我們前期實驗已經證實，HMGB1參與了LN系膜細胞增殖，但其具體機制如何？且其是否參與了腎小球細胞外基質沉積目前尚不清楚。因此我們開展此項研究，通過以LN患者腎穿標本，MRL/ lpr小鼠和HMC細胞系為研究對象，LN患者置換血漿和重組 HMGB1為刺激物，檢測系膜細胞中TLR4的表達水平變化及其與 HMGB1所誘導的系膜細胞增殖和ECM沉積的關系，探討HMGB1是否激活TLR4以介導LN發病中腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質沉積的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 小鼠抗單克隆β-actin抗體(HRP-60008)購買于proteintech公司；人FN ELISA試劑盒(ab219046)、Cell Counting試劑盒8(CCK-8) (ab228554)、兔多克隆TLR4抗體(ab13556)、兔多克隆FN抗體(ab268021)均購買于Abcam公司；TAK242(614316)、甘草酸(glycyrrhizic，Gly)(G2137)購自Sigma公司。HMGB1、Gly及TAK242以細胞培養基稀釋后使用濃度為100 μg ·L-1、2 mmol·L-1和1 mmol·L-1。

1.1.2腎穿標本 收集2016年1月-2018年12月期間由河北醫科大學第二醫院風濕免疫科及腎內科收治的狼瘡性腎炎患者的腎穿石蠟標本，共計30例，所有患者均為初治且診斷明確，符合美國風濕病協會制定的SLE的診斷標準，且患者24 h尿蛋白定量>0.5 g或者連續兩次尿蛋白定量>1+。同時，收集該期間由河北醫科大學第二醫院泌尿外科收治的腎臟腫瘤患者腫瘤組織旁5 cm以外正常腎組織20例設置為對照組。研究中尊重受試者的自主意愿，遵守無風險、不傷害以及公正的原則，同時對受試者個人信息及相關資料的保密措施。

1.1.3實驗動物 30周齡MRL/lpr雌性小鼠10只，體質量(30～35) g，設為狼瘡性腎炎模型組，同周齡同體重MRL/MPJ小鼠10只設為對照組，小鼠均由北京維通利華實驗動物科技有限公司代購自美國Jackson實驗室(實驗動物編號為000485、000486)。實驗動物在SPF級實驗動物飼養室進行飼養，飼養環境為每籠5只，溫度為(22±2) ℃，相對濕度為(55±2)%，各項操作符合河北醫科大學實驗動物飼養管理條例。

1.1.4細胞 人系膜細胞系(HMC)購買于中南大學高等研究中心現代分析測試中心細胞室。

1.1.5LN患者置換血漿 收集河北醫科大學第二醫院風濕免疫科和腎內科LN患者置換血漿5例。研究中尊重受試者的自主意愿，遵守無風險、不傷害以及公正的原則，同時對受試者個人信息及相關資料的保密措施。

1.2 儀器光學顯微鏡(日本Olympus)，全自動多功能酶標儀(美國Thermo Scientific)，Odyssey FC成像儀(美國Li-COR Biosciences)，CO2培養箱(日本SANYO)，超低溫冰箱(青島Haier)，石蠟包埋機(德國LEICA)，石蠟切片機(德國LEICA)，臺式高速低溫離心機(德國Eppendorf)，垂直電泳槽(美國Bio-Rad)，轉移電泳儀(美國Bio-Rad)，轉移電泳槽(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1細胞分組

1.3.1.1 生長狀態良好的人系膜細胞 HMC隨機分為對照血漿刺激組組、LN患者血漿刺激組和LN患者血漿+Gly組(Gly預孵育4H后加入LN患者血漿)，根據MTT結果LN患者血漿濃度選擇5%～10%，LN患者血漿刺激48 h后收取細胞及細胞培養上清，采用ELISA技術檢測HMC細胞培養上清中FN蛋白水平。

1.3.1.2 生長狀態良好的人系膜細胞 HMC隨機分為HMGB1時間梯度刺激組(0、10、20、30、40、50 min)，收取細胞蛋白，Western blot檢測細胞中TLR4和Myd88蛋白的表達水平變化。

1.3.1.3 生長狀態良好的人系膜細胞 HMC隨機分為對照組、HMGB1刺激組和HMGB1+TAK242刺激組(TAK242預孵育1 h后加入HMGB1)，①HMGB1刺激12 h后收取細胞，CCK8試劑盒檢測細胞增殖水平；②HMGB1刺激48 h后收取細胞及細胞培養上清，Western blot技術檢測細胞中FN表達水平， ELISA技術檢測HMC細胞培養上清中FN蛋白水平。

1.3.2ELISA技術 檢測人系膜細胞培養上清FN蛋白水平：嚴格按照說明書要求稀釋標準蛋白制作梯度標準蛋白，后將實驗樣品及稀釋好的標準蛋白加入96孔板中，同時每孔均設立2個復孔； 每孔加50 μL Antibody Cocktail，覆膜后置于37 ℃搖床1 h；加入1× Wash buffer 350 μL后,重復洗板3次并加入底物溶液(100μL/每孔)37 ℃孵育15 min；終止液100 μL以終止反應，使用酶標儀在OD 450 nm處檢測標本IOD值；根據說明書及酶標儀讀數繪制標準蛋白的標準曲線并計算出實驗樣品的蛋白濃度。

1.3.3免疫組織化學技術 檢測對照組和LN患者腎穿標本腎小球細胞中TLR4蛋白表達水平：腎組織常規脫蠟至水；配置枸櫞酸修復液，高壓5 min進行抗原修復并自然晾涼；過氧化氫37 ℃避光孵育20 min去除內源性過氧化物酶； 山羊血清于37 ℃孵育60 min進行封閉；滴加抗TLR4抗體(1 ∶200稀釋)，4 ℃過夜；二抗室溫孵育30 min；三抗室溫孵育30 min；DAB進行顯色；蒸餾水終止顯色；應用蘇木精進行復染，應用1%鹽酸酒精進行分化，氨水進行返藍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并在光學顯微鏡下觀察及拍照。

1.3.4Western blot技術 檢測人系膜細胞中的TLR4和Myd88蛋白的水平：收集蛋白并應用BCA法定量，使用30 μg蛋白通過煮沸10 min變性，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；90 V恒壓濕轉至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入FN(1 ∶1 000)TLR4(1 ∶1 000)、Myd88(1 ∶1 000)和β-actin抗體(1 ∶1 000) 并于4 ℃冰箱搖床過夜；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠 IgG，37 ℃孵育1 h，HRP法化學發光，使用Odyssey FC成像系統顯影并照相，Gel-Pro analyzer進行定量分析，目的蛋白與β- actin的IOD的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.3.5免疫細胞化學技術 檢測MRL/MPJ小鼠和MRL/lpr小鼠腎小球原代系膜細胞中TLR4蛋白表達水平：篩網法提取兩組小鼠腎小球組織，將腎小球懸液加入到預包被膠原蛋白Ⅰ的培養瓶中，37 ℃，5% CO2培養細胞72 h后進行胰酶消化，繼續培養至10 d左右不規則的系膜細胞為主要細胞，收集細胞，4%多聚甲醛固定；3% H2O2甲醇孵育；山羊血清封閉30 min；滴加TLR4抗體(1 ∶200)冰箱4 ℃過夜；后同“1.2.3”。

1.3.6CCK-8技術 檢測HMC的增殖水平： 接種細胞懸液100 μL于96孔板，預先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養；在每孔內加入10 μL的CCK-8試劑，把培養板放置培養箱內2.5 h；在450 nm波長處測定吸光值。

1.3.7統計學分析 實驗結果均應用SPSS 15.0進行統計學分析，實驗中計量資料分析應用獨立樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。

2 結果

2.1 LN患者腎小球細胞TLR4蛋白表達上調免疫組化結果顯示，TLR4蛋白在LN患者腎穿標本腎小球細胞中的表達較為明顯，陽性信號主要定位于腎小管上皮細胞以及腎小球細胞的胞核和胞質，而在癌旁遠端正常腎組織腎小球細胞中無明顯表達(Fig 1)。

Fig 1 Expression of TRL4 in renal biopsy of LN patients and peri-cancer remote tissues detected by immunohistochemistry *P<0.05 vs control group，bar=50 μm

2.2 原代MRL/lpr小鼠腎小球系膜細胞中TLR4表達水平上調免疫細胞化學結果顯示，TLR4在原代MRL/MPJ小鼠和MRL/lpr小鼠腎小球系膜細胞中均表達于細胞質和細胞膜，而與對照小鼠相比，MRL/lpr小鼠系膜細胞中TLR4的表達水平明顯增強，主要定位于腎小球細胞的胞膜及胞質(Fig 2)。

2.3 Gly部分阻斷HMGB1誘導的HMC培養上清中的FN表達水平的上調ELISA檢測結果提示，HMGB1刺激組HMC培養上清中的FN水平較正常對照組明顯升高；與HMGB1刺激組相比， HMGB1+ Gly組HMC的培養上清中FN蛋白水平降低(Fig 3)。

Fig 2 Expression of TRL4 in primary mesangial cells of MRL/MPJ mice and MRL/lpr mice detected by

Fig 3 Expression of FN in culture supernatant of

2.4 HMGB1活化HMC的TLR4/Myd88信號通路Western blot結果顯示，與對照組相比，HMGB1刺激HMC 20 min后，TLR4和Myd88蛋白表達水平上調并逐漸增高，HMGB1刺激50 min后TLR4表達降低至正常水平(Fig 4)。

Fig 4 Expression levels of TLR4 and Myd88 in HMCs

2.5 TAK242部分阻斷 HMGB1誘導的HMC中FN蛋白表達水平的上調Western blot結果顯示，FN蛋白在HMGB1刺激組HMC中的蛋白表達水平較正常對照組明顯上調；而與HMGB1刺激組相比，HMGB1+TAK242組HMC中FN蛋白表達水平下降(Fig 5)。

2.6 TAK242部分阻斷HMGB1誘導的HMC培養上清中的FN表達水平的上調ELISA檢測結果提示，HMGB1刺激組HMC培養上清中的FN水平較正常對照組明顯升高；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+ TAK242組HMC的培養上清中FN蛋白水平降低(Fig 6)。

2.7 TAK242部分阻斷HMGB1誘導的HMC增殖水平的上調CCK-8結果顯示，與對照組相比，HMGB1刺激組HMC的細胞增殖水平明顯升高；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+TAK242組HMC的細胞增殖水平下調(Fig 7)。

3 討論

腎臟組織的病理學改變是腎功能損傷的形態基礎，LN患者的腎臟病理表現多種多樣，腎小球內皮細胞和系膜細胞過度增殖，基底膜纖維素樣壞死，腎小球細胞外基質沉積，腎小管上皮細胞損傷等均參與了腎小球濾損傷的形成，其中腎小球細胞過度增生是LN活動期的主要腎小球病理學改變，細胞外基質沉積則是LN腎小球腎炎進展的終末階段的主要表現之一[3]，因此，本文旨在探明系膜細胞增生及細胞外基質沉積的發生機制，為LN的靶向治療提供堅實的理論依據。

Fig 5 Expression of FN in HMCs detected

Fig 6 Expression of FN in culture supernatant of HMCs

我們的前期實驗圍繞著HMGB1在LN中的作用機制進行了探討。HMGB1已被多項研究的證實可作為炎癥因子或通過模式識別受體途徑參與LN的進程，但其具體機制不明。研究證實[4]，與無腎臟損傷的SLE患者相比，LN患者外周血和尿液中所分離的MPs中 HMGB1的表達均明顯升高，且尿液中HMGB1的水平與SLEDAI評分呈正相關，研究還證實HMGB1在LN患者腎組織中細胞質的表達水平升高。我們在前期實驗中[2,5]使用原位電轉技術，降低MRL/lpr小鼠腎臟中 HMGB1蛋白表達水平，結果發現小鼠尿蛋白水平及腎臟病理改變減輕，腎小球細胞數目增多得到緩解，提示我們在LN發病過程中，HMGB1可能通過促進內皮細胞和系膜細胞增殖參與了蛋白尿的形成，在本實驗中我們同樣發現，HMGB1刺激HMC以后48H細胞的增殖水平增高。

Fig 7 HMC proliferation detected by CCK-8

同時還有研究發現LNⅤ型患者尿液中HMGB1水平明顯上調[6]，提示了HMGB1細胞外基質沉積的可能關系，因此我們推測HMGB1可能還與LN發生中細胞外基質沉積相關。而ECM過度沉積是腎小球硬化發生的病理學基礎，這可能是由Ⅳ型膠原蛋白(typeⅣ collagen，collagenⅣ)、纖連蛋白(fibronectin，FN)、蛋白多糖、糖胺聚糖等膠原蛋白和非膠原糖蛋白合成增多或降解減少造成的[7]。ECM過度沉積過程受到多種機制調控，如TGF-β[8]及IL[7]可作用于腎小球細胞，導致腎小球硬化，TGF-β還被證實介導細胞外基質的沉積。近年研究發現，HMGB1也與細胞外基質釋放相關[9-10]。我們在本研究中首先使用LN患者置換血漿作用于HMC，結果發現，LN患者置換血漿可以上調人系膜細胞中的FN分泌，而當我們同時使用了甘草酸后，結果發現，LN患者置換血漿所誘導的FN表達和分泌增加的現象受到了部分抑制，因此我們考慮，HMGB1在LN發病過程中參與了系膜細胞FN的表達與分泌，我們考慮LN患者置換血漿中細胞因子種類繁多，除HMGB1外，其他細胞因子可能也參與這一過程，因此甘草酸的對LN患者置換血漿所引起的系膜細胞的FN蛋白的分泌僅表現部分抑制。接下來我們對HMGB1參與LN系膜細胞增殖和細胞外基質沉積的具體作用機制進行了探討。

胞外的HMGB1需與其受體結合，以激活細胞內相關信號途徑，參與其致炎作用[11]。我們的前期實驗分別檢測了LN患者腎組織相關受體的表達，結果發現，與癌旁遠端正常組織相比，LN患者腎小球細胞中RAGE、TLR2、TLR4及TLR6的表達水平均出現不同程度的升高，我們推測，HMGB1通過與不同受體結合，激活不同信號通路，參與了LN進程中的多種病理性損傷。而以往研究發現TLR4可通過被其配體識別，進而通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，Myd88)依賴性信號通路或非經典信號通路，Myd88通常通過IKKs激活NFkB，使其從細胞質轉移至細胞核，最終引起大量炎性因子合成上調，最終打破細胞內促炎反應和抗炎反應的平衡。已有研究證實，TLR4通過激活KLF/NF-kB信號通路參與PA(palmitic acid)介導的脂肪細胞IL-1的分泌[12]，HMGB1通過與RAGE或TLR2/TLR4結合參與Obstructive sleep apnea,OSA缺氧環境所誘導的腎損傷[13-16],TLR4抑制劑TAK242通過抑制HMGB1誘導的PASMCs的Ca2+通道的活化[10]。在本研究中，我們用TLR4抑制劑TAK242處理細胞，結果發現，與HMGB1處理組相比，系膜細胞培養上清中的FN蛋白表達水平降低，提示TLR4可能參與了HMGB1誘導的系膜細胞的細胞外基質沉積。而CCK8檢測結果則提示TAK242能夠改善HMGB1誘導的系膜細胞的過度增殖。由此我們得出結論，TLR4參與了HMGB1誘導的系膜細胞的過度增殖及細胞外基質沉積進程。

綜上所述，在本研究中我們發現，LN患者外周血中可能存在HMGB1的過度分泌，而HMGB1蛋白可通過識別并結合與腎小球系膜細胞表面的TLR4受體結合，進而促進系膜細胞過度增殖，以及FN和Col Ⅳ等細胞外基質成分的沉積，從而介導了LN發病過程中腎小球細胞數目增多，腎小球硬化等病理進程。