蛇葡萄素對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

方佳慧，桂 春，張 超，熊曉妹，李永華，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，占女性癌癥的第二位[1]。目前在臨床上主要通過(guò)鉑類抗癌藥物為主的化療手段來(lái)治療宮頸癌，但部分患者會(huì)產(chǎn)生鉑類藥物耐藥性及其他不良反應(yīng)，從而影響藥物治療效果[2]。蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)在大葉蛇葡萄等藥材中含量較高[3]，在湖北西部地區(qū)資源較豐富，具有降血糖、降血脂、保肝、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[4]。近年來(lái)[5]，研究表明，AMP具有多種抗腫瘤作用，如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等，但對(duì)宮頸癌方面研究尚少，作用機(jī)制不明確。課題組前期開展了大葉蛇葡萄提取物抗腫瘤活性及作用機(jī)制的初步研究，結(jié)果顯示，AMP對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖有較好的抑制作用。為進(jìn)一步明確AMP抗宮頸癌作用及其機(jī)制，本文選取人宮頸癌SiHa細(xì)胞，從細(xì)胞增殖、周期和凋亡及其可能機(jī)制展開研究，為天然藥物治療宮頸癌提供一定的科學(xué)依據(jù)，對(duì)后期抗癌新藥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸癌SiHa細(xì)胞(批號(hào)：CL-0210)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2藥物與試劑 AMP，購(gòu)自上海源葉生物公司(批號(hào)：S06J6L1，檢測(cè)純度≥98%)；MEM培養(yǎng)基，購(gòu)自武漢普諾賽生命公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司；Hoechst33258和碘化丙啶(PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司(批號(hào)：KGA108)；Rh-123染液購(gòu)自上海碧云天生物公司(批號(hào)：C2007)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、LC3抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；GAPDH、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(英國(guó)RS Biotech公司)；酶標(biāo)儀和電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)Proteinsimple公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌SiHa細(xì)胞用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)AMP組、對(duì)照組和空白組。AMP組每孔加入100 μL不同濃度培養(yǎng)基稀釋液(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)，對(duì)照組含細(xì)胞和培養(yǎng)基，空白組含培養(yǎng)基，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。藥物分別干預(yù)24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑(5 g·L-1)20 μL繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO避光溶解結(jié)晶，490 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔吸光度(A值)，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50。

細(xì)胞增殖抑制率/%=[1-(A給藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%

1.2.3Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，設(shè)對(duì)照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組。干預(yù)一定時(shí)間后，PBS潤(rùn)洗細(xì)胞后固定(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1,500 μL)12 min，每孔加入500 μL濃度為5 mg·L-1的Hoechst33258染色液，室溫避光染色30 min后棄去染色液，PBS潤(rùn)洗3遍，自然晾干后避光條件下置于熒光倒置顯微鏡下用紫外光進(jìn)行觀察，并拍照記錄。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)對(duì)照組、AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組、陰性對(duì)照組(不加染料)、PI單染組及FITC單染組，干預(yù)一定時(shí)間后收集細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次。加入500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，輕輕混勻，避光室溫染色5-15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)置對(duì)照組、AMP(20、40、80 μmol·L-1)藥物組、陰性對(duì)照組(不加PI)細(xì)胞，干預(yù)一定時(shí)間后，PBS重懸離心后，加入2 mL細(xì)胞固定液(-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇)，固定12 h，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次。每管加入Triton X-100、Rnase A、PBS及 PI混合溶液1 mL，常溫染色30 min，流式細(xì)胞儀FL2通道進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位的變化 細(xì)胞培養(yǎng)接種同“1.2.3”。設(shè)置對(duì)照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)藥物組，藥物干預(yù)24 h后收集細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)2次，每管加2 mL濃度為1 mg·L-1Rh-123染色液，37 ℃避光染色30 min后，于1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測(cè)凋亡及相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)見“1.2.3”。設(shè)置對(duì)照組和AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)，干預(yù)一定時(shí)間后，加入裂解液裂解細(xì)胞，冷凍離心收集上清液，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣后凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜。次日加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影并分析結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AMP抑制SiHa細(xì)胞增殖如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，AMP分別作用SiHa細(xì)胞24、48、72 h時(shí)后，在濃度40-320 μmol·L-1內(nèi)，隨著藥物濃度的升高抑制率逐漸增強(qiáng)；當(dāng)AMP濃度分別為40、80、160 μmol·L-1時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)；其中AMP作用SiHa細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為(46.91±2.55)μmol·L-1、(44.22±1.98)μmol·L-1、(40.33±0.54)μmol·L-1。由結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，AMP對(duì)SiHa細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用(P<0.5)，且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。

Fig 1 Effect of AMP on proliferation of SiHa n=3)

2.2 AMP對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1倒置顯微鏡觀察AMP對(duì)SiHa細(xì)胞形態(tài)的影響 如Fig 2所示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整，呈多邊形；隨著AMP濃度的增加(10、20、40、80 μmol·L-1，作用24 h)或作用時(shí)間的延長(zhǎng)(AMP濃度為80 μmol·L-1，分別作用6、12、24、48 h)，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞間間隙增大，細(xì)胞皺縮、變圓，高濃度組細(xì)胞碎裂，說(shuō)明AMP作用于SiHa細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)具有顯著的影響，且形態(tài)學(xué)的變化程度與藥物濃度或作用時(shí)間呈正相關(guān)。

2.2.2Hoechst33258染色法觀察AMP對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響 在熒光倒置顯微鏡下觀察如Fig 3所示，對(duì)照組SiHa細(xì)胞形態(tài)完整、染色均勻，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈淡藍(lán)色熒光；當(dāng)AMP作用時(shí)間為24 h，濃度依次為10、20、40、80 μmol·L-1，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮逐漸增多，碎裂的亮藍(lán)色染色質(zhì)逐漸增多，出現(xiàn)凋亡小體；當(dāng)AMP濃度為80 μmol·L-1，作用時(shí)間分別為6、12、24、48 h，與對(duì)照組比較，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮增多，碎裂的亮藍(lán)色染色質(zhì)增多。結(jié)果表明，AMP可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。

2.2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 如Fig 4所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著AMP濃度的升高凋亡率逐漸增大(P<0.05)；當(dāng)80 μmol·L-1的AMP分別作用SiHa細(xì)胞6、12、24 h后，與對(duì)照組相比，隨著AMP作用時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率逐漸增大(P<0.05)，具有時(shí)效和量效關(guān)系。結(jié)果進(jìn)一步表明AMP可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。

2.3 AMP對(duì)SiHa細(xì)胞周期的影響如Fig 5、Tab 1所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細(xì)胞24 h時(shí)，在0-40 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，G0/G1期分布比例呈上升趨勢(shì)，S期分布比例呈下降趨勢(shì)，在40-80 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，G0/G1期分布比例下降，S期分布比例上升，細(xì)胞周期分別阻滯在S期和G2/M期；當(dāng)AMP濃度為80 μmol·L-1，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并呈一定的時(shí)間依賴性(P<0.05)。結(jié)果證明AMP對(duì)SiHa細(xì)胞周期存在一定的影響。

2.4 Rh-123染色檢測(cè)線粒體膜電位變化如Fig 6所示，當(dāng)不同濃度AMP分別作用于SiHa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著AMP濃度的升高，線粒體膜電位逐漸降低(P<0.05)，具有一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明AMP對(duì)SiHa線粒體膜電位有一定影響，其誘導(dǎo)凋亡可能與線粒體途徑相關(guān)。

Fig 2 Effect of AMP on cell morphology of SiHa cells(×100)

Fig 3 Effect of AMP on nuclear morphology change of SiHa cells(×200)

Fig 4 Effect of AMP on apoptosis of SiHa n=3) *P<0.05, **P<0.01 vs control

Fig 5 Effect of AMP on cell cycle distribution of SiHa n=3)

Tab 1 Percentage of cell cycle distribution of SiHa cells treated-with 80 μmol·L-1 AMP n=3)

2.5 Western blot檢測(cè)AMP對(duì)SiHa細(xì)胞Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響如Fig 7所示，當(dāng)不同濃度AMP作用于SiHa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，Bcl-2/Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平逐漸上升，具有濃度依賴性；當(dāng)80 μmol·L-1AMP分別干預(yù)6、12、24 h時(shí)，Bcl-2/Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平逐漸上升，具有時(shí)間依賴性(P<0.05)。結(jié)果表明AMP激活了凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3，上調(diào)線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)線粒體膜上促凋亡蛋白Bax表達(dá)；同時(shí)進(jìn)一步表明AMP可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。

Fig 6 Effect of AMP on mitochondrial transmembrane potential of SiHa n=3)

Fig 7 Effect of AMP on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in SiHa n=3)

3 討論

AMP是一種主要提取自葡萄科蛇葡萄屬植物的天然黃酮類單體化合物，已有研究報(bào)道其對(duì)多種癌癥具有抗腫瘤活性，如AMP可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡[8]，AMP通過(guò)ROS的生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[9]，課題組前期研究AMP對(duì)HeLa細(xì)胞具有抗腫瘤作用[6-7]。本研究首先通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AMP能顯著抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，采用Hoechst33258染色法、AnnexinV-FITC/PI雙染法及Western blot法從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、凋亡率及凋亡標(biāo)志蛋白方面考察，結(jié)果提示，AMP可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探討AMP抗宮頸癌可能的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)開展細(xì)胞周期和線粒體膜電位研究，PI單染法發(fā)現(xiàn)AMP可使細(xì)胞阻滯在S期和G2/M期。細(xì)胞周期阻滯是指細(xì)胞周期停滯在檢查點(diǎn)，而檢查點(diǎn)的改變可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。細(xì)胞的復(fù)制與細(xì)胞周期相關(guān)，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞周期中S期阻滯不能改變細(xì)胞周期狀態(tài)，絕大多數(shù)癌細(xì)胞依賴G2/M檢查點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制，阻滯細(xì)胞于G2/M期的藥物對(duì)細(xì)胞復(fù)制起到了抑制作用，提示G2/M期阻滯藥物可能是天然化合物治療和預(yù)防疾病的潛在候選藥物[10]。Cyclin家族蛋白為細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其中cyclin A和cyclin B主要調(diào)控S期或M期，cyclin D 和cyclin E參與調(diào)控G1期向S期轉(zhuǎn)變。本研究中結(jié)果顯示，隨著AMP濃度的升高，細(xì)胞周期分別阻滯于S期和G2/M期，可能與S期和G2/M期檢查點(diǎn)相關(guān)的Cyclin家族蛋白表達(dá)水平變化有關(guān)。課題組在后期研究中，可開展相關(guān)周期蛋白的研究，進(jìn)一步確定AMP對(duì)SiHa細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制。Rh-123染色法檢測(cè)顯示隨著藥物作用濃度的升高線粒體膜電位逐漸降低，結(jié)果提示AMP可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與細(xì)胞周期及線粒體途徑相關(guān)。

線粒體途徑是由Bcl-2家族蛋白通過(guò)控制線粒體通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2定位于線粒體外膜，為抑制凋亡標(biāo)志蛋白；Bax為Bcl-2共沉淀對(duì)應(yīng)蛋白，具有促進(jìn)凋亡發(fā)生的作用[11]。當(dāng)Bax/Bcl-2比值升高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，相反抑制細(xì)胞凋亡[12]。為進(jìn)一步證實(shí)AMP可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡，本文檢測(cè)了與細(xì)胞凋亡相關(guān)的代表性Bcl-2/Bax的關(guān)鍵蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，提示AMP可以通過(guò)激活線粒體途徑發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，AMP可抑制SiHa細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，可能通過(guò)抑制線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究表明蛇葡萄素在宮頸癌的治療及臨床應(yīng)用存在一定的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步開發(fā)其藥用潛在價(jià)值，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)相關(guān)研究。