人參皂苷CK對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病的治療作用

王 霧，楊 梅，蔣夢雅，汪丹丹，陳鏡宇，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，安徽 合肥 230032)

銀屑病是由多種因素相互作用引起的慢性鱗屑性皮膚病，病程反復發作，全球患病率為1%-3%，呈現逐年上升趨勢，其中80%以上患者表現為尋常型[1]。近年來[2]，大量文獻表明Th17分泌的細胞因子IL-23、IL-17在銀屑病患者皮膚與血清中明顯升高。銀屑病患者JAK/STAT3通路被激活，磷酸化STAT3的表達較正常人明顯升高。銀屑病臨床治療藥物主要概括為5大類：內服藥、外用藥、物理療法、天然植物用藥以及生物制劑。這些藥物的副作用也各不相同，內服與外用藥常伴有皮膚萎縮、紅腫、刺痛、瘙癢、灼燒感；物理療法大大增加了患者皮膚癌患病率；新興生物制劑主要針對中至重度患者，常常伴有嚴重的感染及價格昂貴，臨床應用得以限制[3]。因此尋求經濟、副作用較少的藥物對臨床治療銀屑病有重要意義。

人參皂苷CK(ginsenoside metabolite compound K，GCK)是人參中提取的主要生物活性天然化合物，在人腸道菌群水解為Rg2、Rg3、化合物K等，化合物K被認為是口服人參或人參皂苷后具有代表性的活性代謝物，發揮抗炎免疫作用[4]。課題組前期研究表明[5]，GCK在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)動物模型中發揮抗炎免疫作用，其作用機制與抑制T細胞的活化，減少Th17的分化有關。有研究表明[6]，GCK對咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導的BALB/C小鼠銀屑病模型有改善作用，但作用機制尚未闡明。另有研究表明[7]，GCK通過抑制REG3A/RegIIIg的表達緩解角質形成細胞過度增殖來減輕IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損。GCK對銀屑病治療作用與抑制JAK1/2-STAT3通路有無關聯，仍不清楚。本實驗探討GCK體內用藥對IMQ誘導的小鼠銀屑病的療效和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物BABL/c小鼠，♂，7-8周，購自安徽醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(皖)2017-001，飼養于SPF級動物實驗室。所開展的實驗均經安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準。實驗中涉及的方法均根據動物實驗相關指南和法規進行。

1.2 藥物與試劑GCK(由浙江海正制藥有限公司提供，純度≥98%，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，配制成4個劑量組)(批號：S130901)；甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)購自信誼藥業(批號：036180804)；地塞米松(dexamethasone，DEX)購自安徽金太陽生化藥業(批號：1801192)；BCA 試劑盒購自美國賽默飛公司(批號：UJ290656)；JAK1一抗(批號：GR221662-23)、磷酸化JAK1一抗(批號：GR249635-22)購于Abcam；JAK2一抗(批號：11)、磷酸化JAK2一抗(批號：10)、STAT3一抗(批號：4)、磷酸化STAT3一抗(批號：34)購于美國Cell Signaling Technology公司；PCNA購于Santa Cruz Biotechnology公司(批號：E0119)；K1一抗購自Proteintech；。EDTA抗原修復液(批號：19042401)、免疫組化通用二步法試劑盒(批號：K196915D)、ECL 化學發光試劑購于美國賽默飛(批號：TG269475)；IMQ乳膏購于四川明欣藥(批號：19030340)；凡士林乳膏購于天津市博迪化工有限公司(批號：11021)；脫毛膏購于植物醫生溫和套裝(批號：ACG0800604)；Mouse IL-17 ELISA kit(批號：2001-1)、Mouse IL-23 ELISA kit(批號：1912-1)購于深圳達科為生物技術股份有限公司。

1.3 儀器Olympus倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；石蠟切片機(德國萊卡)；多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；低溫高速離心機(美國Sigma)；化學發光成像系統(美國GE公司)；1 mL玻璃勻漿器(廣州優博實驗器材有限公司)。

1.4 銀屑病模型的建立隨機將BALB/C小鼠分為如下組(每組10只)：正常對照組、模型組、MTX(2 mg·kg-1)組、DEX(5 mg·kg-1)組、GCK 14、28、56、112 mg·kg-1。造模前3 d，背部脫毛2 cm×3 cm范圍，觀察小鼠背部脫毛情況，進行二次脫毛。造模當天，除正常對照組外的小鼠于背部皮膚上涂抹約62.5 mg IMQ乳膏(5%)，正常對照組小鼠背部涂抹等量凡士林。各給藥組灌胃給藥，正常對照組小鼠灌等量溶媒，連續7 d。

1.5 小鼠背部皮膚觀察每日同一時間段用數碼照相記錄皮損變化，對小鼠皮損處3個指標(鱗屑、增厚、紅斑)的程度采用PASI評分，3者評分之和為總分。PASI 評分標準：0～4分，分別表示無、輕度、中度、重度、極重度，總分為3個指標分數之和(0～12分)。d 8小鼠進行眼球取血，取脾臟、胸腺和背部皮膚，25%皮膚用4%組織固定液常溫保存，其余組織均放置-80 ℃保存。

1.6 小鼠皮膚組織病理學觀察取出固定液中的皮膚，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察，拍照。每張切片隨機取3處，測量角質層到基底層的垂直距離，統計分析表皮厚度變化。

1.7 免疫組化檢測小鼠皮膚中PCNA的表達將石蠟切片脫蠟水化，封閉，加抗原修復液進行冷修復，一抗4 ℃孵育過夜，次日室溫放置30 min后，先滴加反應增強液室溫反應10 min，后滴加二抗，室溫反應20 min，DAB顯色5-8 min，蘇木精復染20 s，脫水，封片，顯微鏡觀察PCNA的表達情況。

1.8 Western blot檢測相關蛋白的表達取凍存的皮膚組織，按照組織裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制=100 ∶1 ∶1比例研磨，14 000×g離心20 min，取上清，BCA蛋白定量；電泳；用PVDF膜進行轉膜；TPBS配制脫脂牛奶(5%)在37 ℃溫箱中孵育2 h；洗膜，孵育一抗，4 ℃結合12 h以上；洗膜；37 ℃孵育二抗2 h；洗膜顯影。

1.9 ELISA檢測小鼠背部皮膚中IL-17、IL-23的表達按照試劑盒的說明書進行，在IL-17、IL-23細胞因子檢測板中加入樣本(稀釋4倍)或對應的標準品并設置對照，嚴格按照試劑盒說明書操作，加檢測抗體孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入顯色劑顯色反應5～30 min后，加終止液使反應終止，10 min內在酶標儀設置參考波長610 nm～630 nm，檢測波長450 nm測出各孔吸光度值，用ELISACALC軟件繪制標準曲線并計算出各只小鼠皮膚中炎癥因子的水平。

2 結果

2.1 小鼠皮膚形態觀察d 1～2，正常對照組小鼠皮膚均光滑平整；與正常對照組相比，IMQ誘導的小鼠在d 1就表現出輕微鱗屑，皮膚微微泛紅；d 3鱗屑增多，涉及大面積皮膚，并且出現明顯增厚現象，可見明顯的紅斑；d 5鱗屑分布更加密集，增厚現象進一步明顯，紅斑顏色也進一步加深；d 7鱗屑幾乎布滿整片背部皮膚，皮膚厚度明顯增加，肉眼可見的紅斑。MTX、DEX組小鼠皮損明顯改善，GCK給藥組小鼠皮膚損傷減輕，見Fig 1。

2.2 GCK對小鼠皮膚PASI評分的影響每天同一時間段用數碼相機記錄小鼠皮損情況，據PASI評分標準進行評分。小鼠鱗屑、增厚、紅斑評分在d 1～d 7均持續升高(P<0.05)。將3者評分相加得到總分，總分在d 1～d 7內持續升高，各給藥組PASI評分降低(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Effect of GCK on back skin of mice induced by IMQ n=10)

Fig 2 Effect of GCK on PASI scores of mice induced by n=10)

2.3 GCK對小鼠組織病理學及表皮厚度的影響從HE染色中可以看出對照組小鼠皮膚結構正常，表皮層細胞只有2-3層。IMQ誘導的小鼠表皮明顯增厚，角化不全，角化過度，炎性細胞浸潤，顆粒層變薄，棘突延長等。GCK給藥組可以改善上述變化，見Fig 3。選取HE切片400×的視野，每只小鼠切片選取一個視野，使用ImageJ軟件在每個視野中隨機量取3處表皮的垂直距離，取其平均值。與正常對照組小鼠相比，IMQ誘導的小鼠表皮厚度明顯增加(P<0.01)，與模型組相比，各給藥組小鼠表皮厚度明顯減小(P<0.05)，見Fig 3。

2.4 GCK對小鼠表皮中PCNA、K1表達的影響PCNA可以反映角質形成細胞的增殖程度。如Fig 4A所示，對照組小鼠表皮PCNA在表皮基底層少量表達，IMQ誘導的小鼠表皮PCNA表達明顯增多，呈多層分布，PCNA陽性細胞表達明顯增加。與IMQ誘導的小鼠相比，給藥組小鼠表皮PCNA陽性細胞表達減少。皮膚表皮中K1是表皮細胞正常分化的標志。與正常組相比，模型組小鼠皮膚中K1表達降低；與模型組相比，各給藥組小鼠皮膚中K1表達明顯升高(P<0.05)，見Fig 4B。

2.5 GCK對小鼠皮膚JAK1/2-STAT3信號通路的影響與正常組相比，模型組小鼠皮膚中磷酸化的JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達升高(P<0.05)，與模型組相比，各給藥組均能降低JAK1、JAK2、STAT3的磷酸化水平(P<0.05)。提示GCK可能抑制JAK1/2-STAT3信號通路緩解小鼠銀屑病，見Fig 5。

2.6 GCK對小鼠背部皮膚IL-23、IL-17水平的影響如Fig 6所示，與正常組相比，模型組小鼠皮損中IL-23、IL-17水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠皮損中IL-23、IL-17水平明顯降低(P<0.01)。

3 討論

GCK是具有我國自主知識產權的新型活性單體，在我國已注冊為1.2類新藥，并已完成RA的臨床前研究和I期臨床試驗，目前正在進行GCK治療RA的II期臨床試驗。結合臨床前長期毒性研究和Ⅰ期臨床試驗綜合顯示，GCK具有良好的安全性和耐受性[8]。本課題組前期完成了GCK治療RA的臨床前藥效學評估，結果顯示GCK具有抗炎免疫調節作用，其機制與抑制T細胞的活化，減少Th17的分化有關[9-12]。

Fig 3 Effect of GCK on histological changes of skin in mice induced by IMQ

Fig 4 Effect of GCK on expression of PCNA (×200) and keratin1 in skin of mice induced by IMQ n=6)

Fig 5 Effect of GCK on expression of p-JAK1, p-JAK2, and p-STAT3 in skin of mice induced by IMQ n=6)

Fig 6 Effect of GCK on levels of IL-17 and IL-23 in skin of mice induced by IMQ n=6)

銀屑病發病機制中，IL-23、IL-17的激活促使炎癥發生，樹突狀細胞分泌的IL-23與Th17細胞上的受體結合，刺激Th17細胞分泌IL-17、IL-22等細胞因子。IL-23不僅可以誘導角質形成細胞增殖，還促進新生血管生成并募集中性粒細胞與巨噬細胞等。銀屑病的許多關鍵致病介質，包括IL-23、IL-17的激活，都與JAK1/2-STAT3信號通路的活化有關。與正常皮膚相比，銀屑病患者受損皮膚JAK1/2-STAT3信號通路上調[13]。作為銀屑病治療靶標的IL-23、IL-17和JAK1/2-STAT3信號通路已經成為新藥開發的重要方向，靶向抗IL-23、IL-17的藥物對銀屑病有明顯療效。銀屑病患者給予IL-17受體單克隆抗體、JAK1/2的抑制劑12周后情況明顯改善，通過阻斷IL-17A與IL-17受體結合的單抗已陸續上市[14]。

IMQ乳膏最初用于局部治療由人類乳頭瘤病毒引起的殖器和肛周感染，是一種Toll樣受體7配體，具有強大的免疫激活作用。臨床研究發現，無論是在銀屑病患者使用部位還是未使用部位，IMQ會加速銀屑病病灶的出現。局部連續7 d涂抹IMQ構建的急性銀屑病模型，增強了IL-23、IL-17及 JAK1/2-STAT3的表達[15]。本實驗結果表明，GCK可以降低PASI評分，改善皮膚鱗屑、增厚、紅斑、角化不全、角化過度、炎性浸潤等皮膚病理狀況，提示GCK對IMQ誘導的銀屑病小鼠的治療作用。

表皮正常分化的信號表現為角質細胞進入基底層后，K1開始大量表達。銀屑病的臨床特征性表現為表皮細胞異常增生和分化。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組表皮中PCNA表達明顯增加，K1表達降低，GCK給藥后，PCNA表達降低，K1表達明顯增強；提示GCK可能通過抑制角質形成細胞異常增生，促進正常分化來改善IMQ誘導的銀屑病小鼠的皮膚損傷。進一步研究表明，GCK能降低p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3的表達，降低炎癥因子IL-23、IL-17的水平；提示GCK治療IMQ誘導的銀屑病小鼠可能與下調IL-23、IL-17，抑制JAK1/2-STAT3活化有關。

綜上所述，GCK可以緩解IMQ誘導的小鼠銀屑病損傷，其作用機制可能與抑制JAK1/2-STAT3活化有關。GCK作為天然藥物來源成分，具有耐受性好、不良反應少等優點，本研究為治療銀屑病提供實驗依據。