天麻素對戊四氮致癇模型大鼠的治療作用及對細胞自噬、凋亡機制的研究

翁檸，況時祥，薛紅，何前松，王強，劉建輝，趙芝蘭，李艷

癲癇是大腦神經元突發性異常放電，導致大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。癲癇的病因復雜多樣，常見的有遺傳因素、腦部疾病、全身性或系統性疾病[2-3]。其中先天及圍產期因素、遺傳代謝性疾病、皮質發育異常所致的畸形等病因多發生于新生兒及嬰兒期；而特發性、中樞神經系統感染、腦發育異常等多發生于兒童及青春期；頭顱外傷、腦腫瘤、中樞神經系統感染性因素等多發生于成人期；腦血管意外、腦腫瘤、代謝性疾病、變性病等則多發生于老年期[4-5]。根據我國最新流行病學資料顯示，國內癲癇病患者日益增加，已經發展成為神經科內僅次于頭痛的第二大常見病[6-7]。因此，本研究建立戊四氮致癇大鼠模型，積極探索癲癇的發病機制及癲癇的有效治療藥物，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物： Wistar健康雄性大鼠(購于三峽大學動物實驗中心)120只，體質量160～220(180.50±37.52)g，于室溫24℃、濕度45%的干凈籠子里喂養，飲水和飼料均進行消毒之后自由食用。(2)試劑試藥：天麻素(源葉生物公司生產)、戊四氮(PTZ)(Sigma公司生產)、10%水合氯醛(上海雅吉生物科技有限公司生產)，PBS緩沖液(國藥集團化學試劑有限公司生產)，蛋白緩沖液(上海谷研實業有限公司生產)，TBST液(國藥集團化學試劑有限公司生產)，4%多聚甲醛(臨沂盛陽化工有限公司生產)，兔抗小鼠Bax抗體(Selleck公司生產)，大鼠抗兔Beclin1抗體(CiteAbc公司生產)，大鼠抗小鼠Caspase-3(Abcom生產)，兔抗大鼠LC3抗體(Bioworld生產)。(3)儀器設備：光學顯微鏡(BX53型，OLYMPUS，奧林巴斯株式會社生產)，電泳儀(型號 YQDL001/YQDL002，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品)，成像儀(型號 Lux2 ，普邁精醫科技有限公司產品)。

1.2 實驗方法 2018年11月—2019年11月于貴州中醫藥大學實驗室進行實驗。

1.2.1 癲癇模型制作：大鼠自由飲水和攝食5 d后，使用戊四氮(32 mg·kg-1·d-1)+生理鹽水配制成濃度為2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，每次給藥后觀察30 min,連續注射28 d；停藥7 d后，再次同樣使用PTZ亞驚厥劑量32 mg·kg-1·d-1+生理鹽水配制成濃度為2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，連續5 d。根據Racine分級法對大鼠行為驚厥評分分級，凡連續4次出現2級以上發作或者連續出現2次5級癇性發作即判定該鼠被點燃，視為造模成功。通過篩選將造模成功的100只癲癇模型大鼠以隨機數字表法分為戊四氮致癇模型組、丙戊酸鈉(VPA)干預組、天麻素小劑量干預組、天麻素中劑量干預組、天麻素大劑量干預組，每組20只，另外20只為正常對照組，共120只。造模成功后除正常對照組外，各組均予維持量PTZ(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射維持癇性發作。在腹腔注射PTZ之前2 h，模型組腹腔注射生理鹽水,天麻素小、中、大劑量干預組分別于大鼠腹腔注射天麻素30、60、120 mg·kg-1·d-1，丙戊酸鈉干預組于大鼠腹腔內注射丙戊酸鈉(120 mg·kg-1·d-1)，共治療14 d。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 腦組織取材：當大鼠造模成功并干預2周后，取其腦海馬組織進行切片(統一取左側海馬組織)，大鼠造模最后一次注藥1 d后，采用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉之后斷頭取腦，腦組織放在冰盤內沿矢狀縫對切，左側海馬區組織使用4%多聚甲醛進行固定，然后進行脫水、浸蠟后包埋，以備切片。

1.3.2 免疫組化檢測微管相關蛋白輕鏈(LC3)、Bax表達：對大鼠海馬組織石蠟切片行脫蠟、脫水等處理后，浸泡于0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中，并進行熱修復，3% H2O2環境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環境中培養30 min，抽離封閉液、添加一抗，將其置于5℃環境中過夜培養，次日加入二抗，37℃恒溫箱中培養30 min，清洗后進行封片。LC3、Bax陽性表達為棕黃色或黃色細顆粒狀，使用半定量評分法對染色結果進行評定，每切片取10個高倍視野，取其平均值為最終判定結果。

1.3.3 Western-blot法檢測自噬相關蛋白(Beclin1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達：首先使用PBS緩沖液對海馬區組織標本進行沖洗，隨后裂解30 min，裂解后測定其蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質進行電泳，電泳的同時加入蛋白緩沖液，10 min后把電轉膜放置到濃度為10%牛奶中進行浸泡，常溫環境下封閉2 h。封閉后結合一抗孵育1 d，第2天取出后使用TBST液進行沖洗，隨后結合二抗。1 h后進行清洗、顯色，對Beclin1、Caspase-3表達進行檢測。

1.3.4 TUNEL法檢測海馬區細胞凋亡率：海馬組織于常溫環境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進行徹底清洗，將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應液100 μl，避光、室溫環境中孵育1 h，之后加入SSC溶液100 μl，常溫環境中靜置20 min后進行清洗3次，使用DAPI進行復染，滴加DAPI避光孵育 5 min，對標本進行染核，PBST 洗去多余的DAPI。用吸水紙擦干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片中凋亡的細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。取每切片3個視野進行觀察、計算細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 大鼠存活情況 實驗過程中，模型組大鼠死亡2只，天麻素小劑量組死亡2只，天麻素中劑量、大劑量組及丙戊酸鈉干預組死亡各1只，最終存活大鼠113只。

2.2 各組大鼠腦組織LC3、Bax表達比較 與正常對照組比較，模型組LC3、Bax表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，天麻素各劑量組、丙戊酸鈉干預組LC3、Bax表達量表達均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙戊酸鈉干預組比較，天麻素小劑量、中劑量組LC3、Bax表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，天麻素大劑量組LC3、Bax表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；LC3、Bax表達量在天麻素小、中、大劑量各組間依次下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1、2。

表1 各組大鼠腦組織LC3、Bax表達比較

2.3 各組大鼠腦組織Beclin1、Caspase-3表達比較 與正常對照組比較，模型組Beclin1、Caspase-3表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，天麻素各劑量組、丙戊酸鈉干預組Beclin1、Caspase-3表達量均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙戊酸鈉干預組比較，天麻素小劑量、中劑量組腦組織Beclin1、Caspase-3表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，天麻素大劑量組Beclin1、Caspase-3表達量差異無統計學意義(P>0.05)；Beclin1、Caspase-3表達量在天麻素小、中、大劑量各組間依次下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組大鼠腦組織Beclin1、Caspase-3相對表達量比較

圖1 各組大鼠海馬區LC3表達比較(免疫組化染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬區Bax表達比較(免疫組化染色， ×200)

注：A.正常對照組；B.模型組；C.天麻素小劑量組；D：天麻素中劑量組；E：天麻素大劑量組；F：丙戊酸鈉干預組

2.4 各組大鼠海馬區細胞凋亡率比較 與正常對照組(2.91±0.53)% 比較，模型組海馬區細胞凋亡率[(58.77±4.52)%]升高(t=54.930，P=0.001)；與模型組比較，天麻素小劑量組(21.58±2.71)%、天麻素中劑量組(12.74±2.10)%、天麻素大劑量組(9.19±1.88)%、丙戊酸鈉干預組(9.21±1.85)%,海馬區細胞凋亡率依次降低，差異均有統計學意義(F=20.591 ，P=0.031)；而丙戊酸鈉干預組海馬區細胞凋亡率與天麻素大劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

3 討 論

天麻是著名的中藥材，潤而不燥，主入肝經，長于平肝息風，其性辛、溫、無毒，有抗癲癇、抗驚厥、鎮靜、鎮痙、鎮痛、平肝息風的功效。天麻主要含天麻素、天麻醚苷、天麻多糖、對羥基苯甲醇、香莢蘭素、蛋白質、氨基酸、微量元素等多種成分，其中天麻素是天麻的主要活性成分，其含量高低是天麻質量的重要指標。天麻素能夠擴張腦血管、提高腦細胞抗缺氧能力、增加腦血流量，對神經細胞進行保護，清除過多的自由基，增強巨噬細胞的吞噬功能等[8-9]。戊四氮又稱卡地阿唑，一種白色結晶的粉末狀化學品，為中樞興奮藥[10],也是研究較多的癲癇動物模型誘導藥之一。癲癇是一種反復發作的慢性腦部疾病，其有著反復性和短暫性的特點[11-12]。迄今為止，仍有部分難治性癲癇患者無法得到治愈。所以研究癲癇的發病機制及治療癲癇的新型藥物，具有重要意義。

癲癇的發病機制至今尚未完全明確，近年來研究認為，癲癇發生與海馬區細胞程序性死亡如凋亡與自噬密切相關[13-14]。細胞的過度自噬反而會加重細胞損傷程度，嚴重的可能會致使細胞死亡[15-16]。細胞自噬是形成雙層膜的自噬泡，將細胞質內的物質包裹起來，然后通過溶酶體融合并消化掉的過程。LC3是酵母自噬相關基因8，主要存在于哺乳動物中，在自噬體的形成階段，LC3-Ⅰ被包括Atg3和Atg7在內的泛素樣體系修飾加工，轉變為LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中。自噬小體中的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都可以作為細胞發生自噬的分子標志，同時LC3-Ⅱ的水平與自噬表達程度呈正相關，因此LC3可以作為自噬水平的檢測指標。Bax屬于兔抗人單克隆抗體，是與Bcl-2同源的水溶性相關蛋白，是Bcl-2基因家族中細胞凋亡促進基因，Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于死亡[17-19]。自噬相關蛋白Beclin1不僅能夠促進真核細胞的自噬，同時還參加了細胞的凋亡調節。吳瓊等[20]在研究中指出，癲癇模型大鼠體內自噬相關蛋白Beclin1表達異常升高，說明Beclin1表達能反映大鼠海馬神經元的自噬活動。Caspase-3為一種蛋白酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的核心酶，大多數學者認為Caspase-3的出現是細胞凋亡的標志[21-22]。當炎性因子和信號蛋白相應激活Caspase-8后會引起級聯反應，從而激活Caspase-3引起細胞的凋亡。有研究報道，Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T淋巴細胞(CTL細胞)殺傷機制的重要組成部分[23-24]。

綜上，天麻素能調控戊四氮致癇模型大鼠海馬區細胞凋亡、自噬相關因子LC3、Bax、Caspase3、Beclin1等表達，提示天麻素可通過調節凋亡、自噬發揮神經保護作用，抑制癲癇發作，為臨床治療提供一定的理論依據。

圖4 各組大鼠細胞凋亡率比較(熒光染色,×200)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

翁檸：提出研究方向、研究思路，研究選題，論文撰寫，論文修改審核；況時祥：研究選題分析，論文修改；薛紅：設計論文框架，分析試驗數據;何前松：進行文獻調研與整理；王強：進行統計學分析；劉建輝：實驗數據統計分析；趙芝蘭、李艷：實施研究過程