血清LncRNA MEG3、miR-141表達對類風濕性關節炎診斷價值分析

張學平，金鈺，邵宏偉，王丹，王靜

類風濕性關節炎是一種以關節滑膜炎為主的慢性系統性自身免疫性疾病，臨床主要表現為手、足小關節等處多發性關節炎，可導致患者關節疼痛、損壞甚至功能喪失，嚴重影響患者生活質量[1]。目前臨床多采用影像學結合相關標志物對類風濕性關節炎進行診斷和評估，但診斷效能仍較低[2]。 研究表明，長鏈非編碼RNA母系表達基因3(LncRNA MEG3)在骨性關節炎患者軟骨組織中表達量明顯降低，與軟骨退化程度密切相關[3]。Li等[4]研究發現，強直性脊柱炎患者LncRNA MEG3表達下調，可靶向調控炎性因子表達發揮抗炎作用，可作為治療靶點。微小RNA-141(miR-141)在骨性關節炎大鼠模型脊髓背角細胞中表達上調，可促進關節疼痛的發生[5]。LncRNA MEG3與miR-141在結直腸癌化療耐藥進展中存在調控關系[6]，但類風濕性關節炎中二者作用關系尚不清楚。現分析類風濕性關節炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平及其與疾病發生發展、預后的關系，并對類風濕性關節炎的診斷和預后進行評估，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2018年1月鞍鋼集團公司總醫院風濕免疫科診治類風濕性關節炎患者191例(病例組)，其中男88例，女103例，年齡27～63(48.13±9.54)歲；病程0.5～4.6(2.37±0.71)年。以病情變化分為活動期98例(活動亞組)，緩解期93例(緩解亞組)。活動亞組男42例，女56例，年齡27～63(47.72±9.15)歲；病程0.5～4.5(2.31±0.64)年；以膝、踝等負重關節腫脹疼痛為首發癥狀53例，以手、足等外周小關節腫脹疼痛為首發癥狀45例。緩解亞組男46例，女47例，年齡28～63(48.64±9.79)歲；病程0.5～4.6(2.39±0.73)年；以膝、踝等負重關節腫脹疼痛為首發癥狀47例，以手、足等外周小關節腫脹疼痛為首發癥狀46例。另選取同期在醫院體檢的健康者90例為健康對照組，其中男39例，女51例，年齡27～62(48.06±9.13)歲。3組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準同意，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①根據美國風濕病學會診斷標準[7]，確診為類風濕性關節炎；②臨床資料完整；③依從性較好。(2)排除標準：①合并其他自身免疫性疾病；②合并高血壓、糖尿病及感染性疾病；③患有精神疾病及肝、腎功能嚴重不足者；④有既往治療史患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平檢測：患者于入院翌日晨、健康者于體檢時分別采集空腹外周靜脈血5 ml，離心分離血清，于-80℃保存備用。上述血清采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測LncRNA MEG3、miR-141表達水平。血清樣本在冰上完全解凍后使用RNA提取試劑盒(德國Roche公司生產)提取總RNA。使用反轉錄試劑盒(加拿大ABM公司生產)對RNA進行反轉錄，獲得cDNA。再使用qRT-PCR試劑盒(德國Roche公司生產)進行qRT-PCR試驗，20 μl反應體系如下：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。將反應體系按如下步驟進行反應：95℃ 7 min，1個循環；95℃ 15 s、62℃ 32 s、73℃ 15 s，40個循環，1個樣品重復3次。LncRNA MEG3以GAPDH為內參基因，miR-141以U6為內參基因，采用2-△△CT法計算血清LncRNA MEG3、miR-141相對表達水平。試驗所用引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，見表1。

1.3.2 血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平檢測：采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3) 表達水平，嚴格按照試劑盒(美國Abcam公司生產)說明書進行操作。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 各組血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較 血清LncRNA MEG3表達水平比較，活動亞組<緩解亞組<健康對照組，而miR-141表達水平比較，活動亞組>緩解亞組>健康對照組(P均<0.05)，見表2。

表2 各組受試者血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較

2.2 各組血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平比較 健康對照組、緩解亞組、活動亞組血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均依次升高，差異均有統計學意義(P均<0.01)，見表3。

表3 各組受試者血清IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平比較

2.3 血清LncRNA MEG3、miR-141表達與炎性因子相關性分析 血清LncRNA MEG3與血清miR-141表達水平呈負相關(r=-0.432，P=0.000)。血清LncRNA MEG3與血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈負相關(P<0.01)，血清miR-141與血清IL-6、TNF-α、MMP-3水平均呈正相關(P<0.01)，見表4。

表4 血清LncRNA MEG3、miR-141表達與炎性因子相關性

2.4 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷類風濕性關節炎效能 利用ROC綜合分析血清LncRNA MEG3、miR-141水平診斷類風濕性關節炎的價值。血清LncRNA MEG3診斷類風濕性關節炎的AUC為0.801(95%CI0.744～0.858)，截斷值為0.80，其診斷敏感度為78.00%，特異度為72.20%,約登指數為0.502。血清miR-141診斷類風濕性關節炎的AUC為0.822(95%CI0.768～0.875)，截斷值為1.84，其診斷敏感度為77.50%，特異度為83.30%,約登指數為0.608。二者聯合檢測診斷類風濕性關節炎的AUC為0.867(95%CI0.813～ 0.921)，敏感度為89.60%，特異度為79.90%,約登指數為0.695，見圖1。

圖1 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷

2.5 影響類風濕性關節炎發生的危險因素分析 以是否發生類風濕關節炎為因變量，以血清LncRNA MEG3、miR-141、IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平為自變量建立Logistic回歸模型。高miR-141、高IL-6、高TNF-α、高MMP-3水平是影響類風濕性關節炎發生的危險因素，而高LncRNA MEG3水平是其發生的保護因素(P<0.01)，見表5。

表5 影響類風濕性關節炎發生的危險因素分析

3 討 論

類風濕性關節炎患者多表現為手、足、腕、膝關節等部位受累，出現腫脹、畸形、脫位等，若累及其他器官可出現心肌炎、冠狀動脈炎、皮膚潰瘍、間質性腎炎等，嚴重影響患者身心健康[1]。目前類風濕性關節炎的發病機制尚不明確，但多數研究認為，T淋巴細胞及巨噬細胞釋放大量炎性細胞因子引起骨關節破壞是類風濕性關節炎發病的主要機制[8]。

LncRNA是一類長度大于200個核苷酸的轉錄RNA，可調控機體蛋白質合成，并在疾病進展中發揮重要作用。Chen等[9]研究發現，骨關節炎中LncRNA MEG3表達明顯下調，可調控軟骨細胞增殖、凋亡、細胞外基質降解和炎性反應。本研究結果顯示，類風濕性關節炎患者血清LncRNA MEG3表達水平明顯降低，且活動亞組低于緩解亞組，與LncRNA MEG3在骨關節炎進展中表達趨勢一致，提示LncRNA MEG3水平降低可能通過預示炎性反應水平上調和軟骨細胞活性增強，反映類風濕性關節炎發生發展進程。LncRNA MEG3可減少炎性細胞因子產生，緩解肺部細菌感染小鼠促炎反應，在膿毒癥抗菌免疫進展中有重要作用[10]。Tong等[11]研究報道，糖尿病視網膜病變中高糖可通過抑制LncRNA MEG3表達，促進TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，影響疾病加重。有研究報道，過表達LncRNA MEG3可通過減少TNF-α、IL-6緩解骨關節炎兔模型的疼痛和炎性反應[12-13]。MMP-3是預測類風濕性關節炎患病嚴重程度及預后的重要生物標志物[14-16]。有研究證實，LncRNA MEG3可通過下調MMP-3來抑制胃癌細胞遷移能力[17]。本研究結果顯示，類風濕性關節炎患者血清LncRNA MEG3與IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均呈負相關，提示LncRNA MEG3水平降低可能通過升高IL-6、TNF-α、MMP-3等炎性細胞因子水平，促進炎性反應，進而影響類風濕性關節炎發生和病情加重。

miRNA長度約20個核苷酸，能夠在各種組織和細胞中穩定存在，可參與機體生理反應和疾病進展。有研究表明，非酒精性脂肪肝炎進展中miR-141高表達，下調其表達可減少肝脂肪變性和炎性反應[18]。股骨頭壞死小鼠模型骨組織中miR-141高表達，抑制其表達可改善成骨細胞活性，抑制股骨頭壞死進展[19]。本研究結果顯示，類風濕性關節炎患者血清miR-141表達水平明顯升高，且活動亞組miR-141表達水平明顯較高，提示miR-141表達上調可能通過影響炎性反應和成骨細胞代謝，促進骨關節破壞及類風濕性關節炎發生發展。miR-141在子癇前期患者胎盤組織中高表達，與病理妊娠的免疫調節密切相關[20]。Rajkumar等[21]研究發現，腦卒中后小鼠腦組織中miR-141表達上調，可靶向調控IL-6、TNF-α促進炎性反應增加，導致神經功能缺損加重和梗死面積增加。骨關節炎中TNF-α可誘導MMP-3表達，促進炎性反應和疾病進展[22]。本研究結果顯示，類風濕性關節炎患者血清miR-141與IL-6、TNF-α、MMP-3表達水平均呈正相關，提示miR-141可能通過影響炎性細胞因子表達，促進骨關節損傷發生，導致類風濕性關節炎發生發展。

研究發現，LncRNA MEG3可通過靶向miR-141促進結直腸癌細胞的化療敏感性[6]。Li等[23]研究表明，類風濕性關節炎患者滑膜細胞中過表達LncRNA MEG3可下調miR-141水平，促進細胞增殖并抑制炎性反應。本研究結果顯示，類風濕性關節炎患者血清LncRNA MEG3與miR-141表達水平呈負相關，提示LncRNA MEG3與miR-141間可能存在相互作用，共同影響類風濕性關節炎進展。本研究還發現，高miR-141水平是影響類風濕性關節炎發生的危險因素，而高LncRNA MEG3水平則是其保護因素，且血清LncRNA MEG3、miR-141水平聯合檢測診斷類風濕性關節炎的曲線下面積、敏感度及特異度最高，提示血清LncRNA MEG3水平降低、miR-141水平升高可能作為類風濕性關節炎發生的預測指標，臨床可通過二者聯合診斷，評估類風濕性關節炎發生。

綜上所述，類風濕性關節炎患者血清LncRNA MEG3低表達、miR-141高表達，二者間可能存在一定相互作用，通過調控炎性反應，參與類風濕性關節炎發生發展進程。但二者間具體調控機制尚需進一步進行試驗探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張學平：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；金鈺：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；邵宏偉：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；王丹：進行統計學分析；王靜：課題設計，論文撰寫