口腔扁平苔蘚患者血清脂肪因子趨化素水平與Th17/Treg比值的相關性

郭明，郭盼，辛越紅，黎煒

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種臨床常見且好發于口腔黏膜的非感染性炎性疾病，其反復發作、可慢性遷延至終身，對患者身心健康造成嚴重影響[1]。但OLP發病原因及機制尚不完全清楚。脂肪因子趨化素(Chemerin)是脂肪細胞因子之一，與慢性腎臟病、潰瘍性結腸炎、慢性胰腺炎、子癇前期等炎性反應相關疾病密切相關[2]。多囊卵巢綜合征患者血清中Chemerin水平明顯上調，經二甲雙胍治療后，其水平明顯下降，其對多囊卵巢綜合征具有一定診斷價值[3]。輔助性T細胞17(Th17)/調節性T細胞(Treg)比例失調可能影響各種免疫失調的炎性疾病發生發展[4]。Th17/Treg比值在OLP患者外周血中升高，其失衡在OLP發病進程中發揮重要作用[5]。但Chemerin在OLP患者血清中的表達情況及與Th17/Treg平衡的關系尚未見相關報道。現分析Chemerin在OLP患者血清中的表達水平及其與Th17/Treg平衡的關系，以期為臨床診治OLP提供依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年7月—2020年3月中國中醫科學院西苑醫院口腔科收治的OLP患者58例作為OLP組，其中男18例，女40例，年齡29～68(46.24±14.87)歲；體質量指數(BMI)17.56～24.35(20.97±2.87)kg/m2；病程1～15(7.46±5.83)個月；病變分型：非糜爛型33例，糜爛型25例。納入同期醫院健康體檢者62例作為健康對照組：男21例，女41例，年齡31～66(45.91±14.72)歲；BMI 17.42～25.02(21.16±2.93)kg/m2。2組性別、年齡、BMI等比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，入選者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)診斷標準：參考《口腔黏膜病學》有關OLP判定標準進行診斷[6]。(2)納入標準：①所有患者臨床表現均符合OLP診斷標準，必要時進行病理確診；②所有患者不伴有牙周炎、皮損、復發性阿弗他潰瘍等其他口腔疾病；③患者自愿參與并完成該項研究。(3)排除標準：①口服藥物、金屬全冠、銀汞合金等引起的苔蘚樣反應者；②合并糖尿病、高血壓等全身系統疾病者；③合并艾滋病、乙肝、結核等感染性疾病者；④合并類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及其他自身免疫性疾病者；⑤處于妊娠期、月經期、哺乳期女性；⑥近期使用過抗生素、糖皮質激素、免疫抑制劑者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 樣本采集：采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血7～8 ml，均分成2份。一份置于無菌EP管中，室溫自然凝集30 min， 離心取上層血清，分裝于凍存管中，于-80℃冰箱中保存備測；另一份置于含肝素抗凝劑的抗凝管備用。

1.3.2 血清Chemerin測定：上述血清采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測Chemerin水平，嚴格按照試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司生產)說明書進行。

1.3.3 外周血Th17、Treg細胞測定：上述血液采用密度梯度離心法及Ficoll淋巴細胞分離液(北京百奧萊博科技有限公司生產)獲得外周血單個核細胞，利用RPMI-1640培養液將外周血單個核細胞密度調整為2×106個/ml，利用流式細胞儀(型號 CytoFLEX，貝克曼庫爾特商貿中國有限公司生產)檢測Th17、Treg細胞含量，計算Th17/Treg比值。

1.3.4 血清IL-17、IL-10 mRNA測定：將保存的血清樣本解凍，無菌環境下，直接采用TRIzol試劑盒(上海彩佑實業有限公司生產)、反轉錄試劑盒Reverse Transcription Kit(廣州昂飛生物科技有限公司生產)提取總RNA并反轉錄成cDNA。參照SYBR Green QPCR mix熒光定量PCR試劑盒(上海經科化學科技有限公司生產)說明書配制反應體系，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)基因擴增儀(型號 T20，杭州朗基科學儀器有限公司生產)進行cDNA擴增，qPCR檢測。IL-17、IL-10均以β-actin為內參，引物由北京百奧萊博科技有限公司合成，其相應引物序列見表1。總反應體系(20 μl)包括：cDNA 3 μl，正向、反向引物各1 μl，SYBR Green QPCR mix 8 μl，DEPC水7 μl。反應步驟：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、70 ℃ 18 s，35個循環；每個樣品重復3次。采用2-△△CT法計算血清IL-17、IL-10相對表達量。

表1 IL-17、IL-10及內參β-actin的引物序列

2 結 果

2.1 2組血清Chemerin和外周血細胞Th17、Treg、Th17/Treg水平比較 與健康對照組比較，OLP組患者血清Chemerin水平和外周血Th17細胞百分比、Treg細胞百分比、Th17/Treg細胞比例均明顯升高(P均<0.05)， 見表2。

表2 2組受試者血清Chemerin和外周血Th17、Treg及Th17/Treg水平比較

2.2 2組血清IL-17、IL-10 mRNA表達比較 與健康對照組比較，OLP組患者血清IL-17、IL-10 mRNA表達水平均明顯升高(P均<0.05)，見表3。

表3 2組受試者血清IL-17 mRNA、IL-10 mRNA表達水平比較

2.3 血清Chemerin與Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17 mRNA、IL-10 mRNA的關系 Pearson法分析顯示，OLP患者血清中Chemerin水平與Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-10 mRNA均呈正相關(r/P=0.461/0.000、0.456/0.000、0.411/0.000、0.477/0.000、0.459/0.000)。

3 討 論

OLP是一種免疫介導的炎性疾病，具有惡變潛能，極可能危及患者生命安全[7-9]。因此，尋找OLP發病相關因素，對盡早診治OLP具有重要意義。

Chemerin是一種趨化因子，在血液及多種組織中均有表達，其可在氧化應激、信號傳導、免疫應答、炎性反應等生物學過程中起重要作用[10-11]。Chemerin在慢性腎臟病患兒血清中呈高表達，其表達水平與腎臟功能障礙有關，有望成為評估心血管疾病并發癥及腎移植后腎結局的生物學指標[12]。Chemerin在潰瘍性結腸炎中表達失調，其可能參與并影響潰瘍性結腸炎疾病的發生發展，可能是治療潰瘍性結腸炎的潛在靶標[13]。Chemerin在慢性胰腺炎中水平上調，其可能在慢性胰腺炎發展進程中發揮重要作用，有可能是診斷慢性胰腺炎的潛在指標[14]。以上研究表明，表達異常的Chemerin與炎性疾病發展過程關系密切。本研究中OLP患者血清Chemerin水平明顯高于健康體檢者，提示其可能在OLP發病進展中起一定作用。分析其原因，Chemerin可能通過調控免疫細胞聚集，促進炎性反應，進而在OLP發展中發揮促炎作用，但仍需深入探究其作用機制。Th17/Treg平衡可有效維持機體免疫穩態，Th17/Treg失衡參與并影響自身免疫性疾病及過敏性疾病等炎性疾病的發展進程，Th17/Treg比值在過敏性哮喘患者外周血中明顯升高，Th17/Treg失衡可能在過敏性哮喘中發揮重要免疫調節作用[15]。賈沛茹等[5]研究發現，Th17/Treg比例在OLP患者外周血中均增加，體內發生Th17/Treg平衡紊亂，與病情嚴重程度相關，調節Th17/Treg平衡，有望為治療OLP提供新靶點。本研究顯示，OLP組患者外周血Th17細胞百分比、Treg細胞百分比、Th17/Treg細胞比值均明顯高于健康對照組，提示Th17及Treg細胞亞群均參與了OLP的全身免疫反應，且以Th17細胞占優勢的Th17/Treg失衡可能在OLP發病過程中發揮免疫調節作用，具體機制有待進一步研究證實。

IL-17是由Th17細胞分泌的標志性促炎因子，可誘導趨化因子和其他細胞因子表達，從而介導炎性細胞聚集、浸潤及組織損傷[16]。本研究顯示，IL-17在OLP患者血清中呈高表達，與王婷婷等[17]研究趨勢一致，提示IL-17可能參與并影響OLP發病過程。分析可能原因，Th17細胞可能被抗原呈遞細胞激活后，釋放IL-17，進而參與OLP的炎性反應過程。IL-10是由Treg等細胞分泌的抑制炎性因子，其可抑制促炎因子的釋放及抗原的提呈，可在免疫炎性類疾病中發揮抑制炎性反應及免疫調節作用，IL-10在OLP外周血中表達上調，其可能在OLP發展進程中起重要作用。本研究中OLP組IL-10表達水平明顯高于健康對照組，與徐建英等[18]研究趨勢相符，提示Treg可能通過分泌IL-10，進而在OLP發生進展中發揮免疫調節作用。IL-10表達水平升高可能是機體全身免疫對局部炎性反應的免疫應激反應；此外，機體通過增加IL-10表達，使巨噬細胞的活化、自身反應性淋巴細胞的激活劑擴增受到抑制，從而維持免疫耐受[19]。

本研究顯示，OLP患者血清中Chemerin水平與Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-10 mRNA均呈正相關，提示Chemerin與Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17 mRNA、IL-10 mRNA相互影響，從而在OLP發病過程中起一定作用，究其原因，Chemerin可能通過炎性介質分泌及表達的改變，從而促進OLP炎性反應過程，且Th17、Treg可能通過抗原刺激分別分泌IL-17、IL-10，從而在OLP疾病發展進程中發揮作用。進一步研究顯示，OLP患者血清Chemerin水平與Th17/Treg細胞比例呈正相關，提示Chemerin的改變可能協同Th17、Treg細胞亞群失衡共同參與OLP發病進展。

綜上所述，OLP患者血清Chemerin表達上調，且外周血Th17、Treg細胞百分比均升高，Th17/Treg平衡失調，Chemerin水平與Th17/Treg存在正相關性，Chemerin、Th17/Treg可能通過相互影響，進而在OLP發生發展中發揮作用。對Chemerin水平及Th17/Treg平衡的深入探究，有望為治療OLP提供新靶點。但本研究仍有不足之處，研究樣本量較少，可能會造成試驗結果發生一定偏差，后續將擴大研究樣本量，進行深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

郭明：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；郭盼：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；辛越紅：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；黎煒：提出研究思路，進行統計學分析