臭氧抑制溶血磷脂酸引起的神經病理性疼痛和背根神經髓鞘相關糖蛋白及 TNF-α 上調*

陳珊雅 彭良玉 王喜連 周忠群 唐 杰 謝 斌 陳素昌

（南華大學附屬第一醫院1 疼痛科；2 麻醉科，衡陽 421001）

大量的研究證實溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA) 在神經病理性疼痛的啟動和維持中起著重要的作用，這意味著LPA 是治療神經病理性疼痛的一個重要的靶點。我們的前期研究也證實，鞘內注射LPA 可以誘導背根神經脫髓鞘產生神經病理性疼痛。醫用臭氧 (ozone, O3) 在臨床上被用于治療各種形式的疼痛包括帶狀皰疹后神經疼痛和三叉神經痛[1,2]，這說明臭氧治療神經病理性疼痛效果較好。國內外對醫用臭氧在動物實驗中對神經病理性疼痛的研究較少，關于臭氧在LPA 誘導的脫髓鞘神經病理性疼痛中的作用尚未見研究報道，臭氧在神經病理性疼痛的具體作用機制目前不明。炎癥因子，如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 在神經病理性疼痛啟動中的作用也一直被受重視。而髓鞘相關糖蛋白 (myeline-associated glycoprotein, MAG) 在髓鞘的形成和維持中也發揮著關鍵的作用。本研究將探討單次椎間孔注射 (intervertebral foramen injection, IVF) 臭氧在LPA 脫髓鞘神經病理性疼痛模型中對TNF-α 及MAG 表達的影響。

方 法

1. 實驗動物

本研究采用健康成年雄性小鼠（體重20～24 g），動物由南華大學動物中心提供。室溫保持50%～60%的濕度和在22±2℃，12 h/12h 黑夜-白天循環照明。動物在安靜環境中分籠飼養，能自由攝取食水。所有實驗步驟都盡量減輕動物的痛苦并按照有關實驗動物的使用原則操作。LPA 脫髓鞘疼痛模型制作：LPA 鞘內注射采用Hylden 和Wilcox等[3]描述的方法，在L5和L6之間的間隙進行。造模后，將小鼠隨機分為人造腦脊液組（LPA + aCSF組）及臭氧組（LPA + O3組），椎間孔臭氧或aCSF 注射按照Ferrari 等[4]描述的方法，在L5左側椎間孔處注射。于注射LPA 前 (t0)、注射LPA 后24 h且注射臭氧或aCSF 前(t1)、注射臭氧或aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)、7 天 (t4)、14 天 (t5)時測定小鼠機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)及熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，每組8 只，共48 只，并在不同時間點(t0、t1、t2、t3、t4) 取其背根神經采用Western blot 方法測定MAG、TNF-α 的表達變化，每組3 只，共30 只。

2. 動物行為學測定

（1）MWT 測定：機械痛敏測試裝置為透明的有機玻璃箱，無底，箱底為金屬網制成（網格為6 mm×6 mm）。在動物行為學測試前為了消除心理因素，把小鼠首先放入有機玻璃箱適應1 h，直至小鼠搔抓、洗臉、行走等活動完全停止，處于安靜狀態時為止。用傳感器指針（美國IITC 電子vonFrey 測痛儀 1601）通過網格垂直刺激小鼠左后肢的足心部。引起小鼠左后肢回縮的壓力值即定義為MWT。設定20 g 的壓力值為分界點，避免組織損傷，以10 min 的間隔對左后肢重復測量3 次，3 次的均值用于最后的統計學分析。

（2）TWL 測定：熱痛敏的測試裝置為有機玻璃箱，無底，箱底為可以加熱的玻璃平板。在動物行為學測試前為了消除心理因素，把小鼠首先放入有機玻璃箱適應1 h，直至小鼠搔抓、洗臉、行走等活動完全停止，處于安靜狀態時為止。將熱刺激器（美國IITC）放在玻璃平板的下面，投射光源的焦點正對小鼠的左后肢的足心部。通過熱刺激器上的鏡子可以看到小鼠的腳底面。設定20 s 為界點，避免組織損傷。以10 min 的間隔對左后肢重復測量3 次，3 次的均值用于最后的統計學分析。

3. 給藥方法

LPA 是由人工腦脊液 (aCSF: 125 mM NaCl, 3.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, pH 7.4) 溶解。鞘內注射是采用Hylden 和Wilcox等描述的方法。以左掌壓住鼠身，拇、中指按住腰骶部兩側固定，食指按在雙側骶骨前緣連線正中點（可觸及L5棘突）指示進針點, 以微量注射器自L5和L6之間的間隙進針。臭氧注射按照Ferrari 等描述的方法。以微量注射器在L5左側椎間孔處注射30 μg/ml 臭氧 30 μl。

4. Western 印跡法測定MAG 和TNF-α 表達

取出不同時段、臭氧和aCSF 處理后的小鼠L4-5雙側背根神經節，切割成四等份，按重量分別加入Tris 裂解緩沖液（50 mMTris-Hcl, PH6.8; 2%SDS; 10%甘油；ddH2O。使用前要加蛋白酶抑制劑），低溫勻漿，超聲破碎，1 5000 rpm 低溫離心后取上清液。用Micro-BCA (Micro BCA Protein Assay Kit pierce) 法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品(20 μg)加入2 μl 上樣緩沖液，混勻后，沸水煮沸10 min。取煮沸后的等量蛋白樣品約30 μl，加入SDS-PAGE膠孔中，于80 V 恒壓，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后濃縮膠電泳60 min，再100 V 恒壓，分離膠電泳90 min。將完整的凝膠取下，轉移到鋪著海綿和濾紙轉移夾中組成“三明治”結構，把事先在轉移緩沖液中浸泡10 min 的PVDF 膜 (Millipore Japan) 緊貼其上，排除氣泡，再在轉移緩沖液中380 mA 恒流轉移90 min。取出PVDF 膜，在TBS 中輕搖5 min，用封閉液（TBST, 5%w/v 脫脂奶粉）25℃封閉2 h在10 ml 一 抗 [anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) , anti-TNF-α (1:1000, Sigma USA)] 稀釋液中(TBST, 5%w/v BSA)把PVDF 膜和一抗共同輕搖孵育，4℃過夜。次日，用TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min。然后用10 ml 過氧化物酶標記的二抗[anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) anti-TNF-a (1:1000, Sigma, USA)] 孵育, 25℃2 h 。用TBST 清洗PVDF 膜，洗脫3 次, 每次10 min，后用1 ml ECL (Pierce chemical, USA) 室溫孵育3 min。排出過量液體，在暗室中使其與X 光片(Kodak, Rochester, NY)緊密接觸，使X 光片感光數秒到數分鐘。顯影，定影，沖洗，晾干，掃描并進行計算機圖象分析。PVDF膜用strip 液50℃洗脫30 min 后重新封閉及加一抗二抗，以β-tubulin [rabbit anti-?-tubulin polyclonal antibody (Santa cruz USA) 1:500] 作為內參確認上樣量基本相同。

圖1 熱閾值和機械性閾值(n = 8, ±SD) (A) 不同組之間的熱縮足反射潛伏期變化的比較；(B) 不同組之間的機械縮足反射閾值變化的比較 *P < 0.05，與LPA-aCSF 組相比；t0：注射LPA 前；t1：注射LPA 后24h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig. 1 Thermal withdrawal latency and mechanical withdrawal threshold (n = 8, ±SD) (A) The comparison of thermal withdrawal latency (TWL) in two groups; (B) The comparison of mechanical withdrawal threshold (MWT) in two groups *P < 0.05, compared with the group LPA-aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection；t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

5. 統計學分析

針對行為學縮足閾值的評估，采用Graph Pad Prism 7.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±SD)表示，采用雙因素方差 (twoway ANOVA) 分析。P< 0.05認為差異有統計學意義。Western-blotting 的結果：膠片用imageJ 進行條帶密度分析，采用雙因素方差(two-way ANOVA) 分析。P< 0.05 認為差異有統計學意義。

結 果

1.小鼠熱閾值及機械性閾值的變化

兩組鞘內注射LPA 后24 h，MWT 和TWL 均明顯降低，LPA + O3組與LPA + aCSF 組相比，椎間孔注射臭氧后24 h 時MWT 和TWL 顯著上升，疼痛緩解，一直持續至第7 天（P< 0.05，見圖1）。

2. 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經TNF-α 表達的變化

在 椎 間 孔 注 射aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)，觀察到LPA + aCSF 組背根神經TNF-α 表達較注射aCSF 前 (t1) 變化不大，7 天 (t4) 時表達有所下降；LPA + O3組在O3注射后24 h (t2)，觀察到背根神經TNF-α 表達較LPA + aCSF 組明顯下降，3 天 (t3) 時最低，維持至第7 天（P< 0.05，見圖2）。

3. 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經MAG 表達的變化

LPA + aCSF 組在椎間孔注射aCSF24 h 后 (t2)，觀察到背根神經MAG 的表達較注射aCSF 前 (t1)明顯下降，第3 天 (t3) 時持續下降，而第7 天 (t4) 與第3 天 (t3) 無明顯變化；LPA + O3組在O3注射24 h (t2)、3 天 (t3) 時，觀察到背根神經節MAG 的表達較LPA + aCSF 組明顯增高，維持在注射臭氧前水平，僅第7 天 (t4) 時MAG 表達較注射臭氧前出現輕微下降（P< 0.05,見圖3）。

圖2 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經TNF-α 表達的變化 (A) 用?-tubulin 標化后兩組TNF-α 蛋白定量的統計圖；(B) 兩組不同時間點TNF-α 的Western blot結果 *P < 0.05,與LPA + aCSF 組相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig.2 The expression of TNF-α protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of TNF-α protein quantification in two groups after ?-tubulin standardization；(B) Western blot results of TNF-α in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

圖3 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經MAG 表達的變化 (A) 用?-tubulin 標化后兩組MAG 蛋白定量的統計圖；(B)兩組不同時間點MAG 的Western blot結果 *P < 0.05,與LPA + aCSF 組相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天 Fig. 3 The alterations of MAG protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of MAG protein quantification in two groups after ?-tubulin standardization; (B) Western blot results of MAG in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

討 論

醫用臭氧是臭氧和氧氣的混合物, 應用于臨床治療已有100 多年的歷史。臭氧具有強烈的刺激性氣味[5]，在常溫下半衰期約20～30 min，數小時后自然分解。臭氧具有很高的能量, 很快自行分解為氧氣和具有很強氧化能力的單個氧原子。在歐洲、俄羅斯和中國，臭氧對于治療慢性疼痛有很好的可信度和治療效果，臭氧已經廣泛用于治療各種形式的疼痛[6～8]。臭氧具有抗炎、抗氧化及鎮痛的作用。另一方面，在臨床上我們通過皮內或神經節注射臭氧發現可以減輕帶狀皰疹后神經疼痛和三叉神經痛病人的疼痛癥狀[1,2]。在1 例5 年帶狀皰疹后神經痛病人的隨訪研究中，通過在皰疹節段的椎間孔注射臭氧發現可以減輕病人的自發性疼痛和觸覺誘發痛[9]。本研究通過在L5左側椎間孔單次注射臭氧，發現小鼠的機械痛敏及熱痛敏1 天后就明顯下降了，且維持到了第7 天，這與Lu 等[10]在坐骨神經壓迫模型中發現不同濃度及劑量臭氧減輕神經病理性疼痛的時間點有很大的相似性，說明了單次劑量的臭氧可以維持很長時間。而且在LPA 脫髓鞘動物模型中的研究與Luo 等[9]發現的椎間孔注射臭氧可以減輕觸覺誘發痛是一致的，雖然維持時間未達到28天。但是關于不同濃度臭氧及不同劑量臭氧在LPA 脫髓鞘神經病理性疼痛中的作用，需要我們進一步去探索。

TNF-α 是神經損傷以及神經炎癥過程中最重要及最早釋放的致炎細胞因子。在本研究中我們通過單次椎間孔注射臭氧后，觀察到背根神經TNF-α 的表達在注射后12 h 立即表達下調，24 h 下降達到峰值，并維持到第3 天，這證實了在LPA 脫髓鞘神經病理性模型中臭氧對TNF-α 有明顯的調節作用。但維持時間較短，這可能與臭氧注射方式的不同及臭氧濃度的不同相關。LPA 啟動神經病理性疼痛的一個機制是誘導外周神經的脫髓鞘。髓鞘不僅僅對神經動作電位的快速傳導是必需的，還對維持軸突的完整性是非常重要。MAG 是一種跨膜的糖蛋白，選擇性的固定于外周施旺細胞和中樞少突膠質細胞髓磷脂鞘的軸突外周（結旁區paranode)，因此認為其介導膠質細胞和軸突之間的信號傳遞[11]。P?iv?l?inen 等[12]在離體實驗當中證實了MAG 在髓鞘形成當中的表達要早于MBP，所以我們認為 MAG 在髓鞘的形成和維持中發揮著重要的作用。另外，我們前期的試驗研究證實單次鞘內注射LPA24 h 后背根神經MAG 明顯的下降，一直持續到第3 天，這也直接說明了MAG 的降解參與了LPA1 受體誘導的背根神經脫髓鞘[13]。在本次試驗中。我們通過同節段L5左側椎間孔單次注射臭氧，發現背根神經MAG 的表達未明顯下降，且可以維持MAG 表達不變到第3 天，直到第7 天的時候才出現下降。這說明臭氧能維持MAG 的完整，第7 天時候的下降與LPA 引起MAG 下降的固有維持時間有關系。之前我們的實驗研究證實LPA誘導MAG 下調是通過鈣蛋白酶通路來調節，是否臭氧通過抑制上游的鈣蛋白酶來保持MAG 表達不變，這是我們需要思考和進一步研究的。另外，在LAP 誘導的脫髓鞘模型中，我們還觀察到MBP、PMP22、和MPZ 等髓鞘蛋白降解，臭氧是否能抑制這些髓鞘蛋白的降解，這也是我們需要進一步探討的。有文獻報道RhoA 信號通路是調節神經軸突再生的主要信號通路。抑制Rho 信號通路對于促進軸突再生, 減少細胞死亡, 改善中樞神經系統損傷及引起的疼痛, 是一種很好的方法。而轉錄因子對于髓鞘形成的調節包括正性調節和負性調節。Parkinson等[14]2004 年在體外實驗中證實了轉錄因子c-Jun 對施旺細胞的增殖和死亡是必需的，而且在髓鞘形成的時候c-Jun 通過Egr2 下調。近期的研究也證實非甾體類的消炎鎮痛藥物可通過抑制RhoA 信號通路激活促進神經軸突的再生而減輕脊髓損傷的癥狀，而臭氧同樣具有抗炎作用[15]，所以我們下一步的研究也將進一步闡述臭氧是否能調節上游水平的鈣蛋白酶和RhoA信號通路表達來減輕神經病理性疼痛。

本研究通過探討臭氧在LPA 脫髓鞘神經病理性疼痛中對TNF-α 和MAG 表達的影響來進一步闡述臭氧在神經病理性疼痛中的具體作用機制，證實了臭氧能減輕神經病理性疼痛，是治療神經病理性疼痛的一個很好的方法。