人誘導性多能干細胞及分化產物在發育毒性研究中的應用

王正媚，裴軼勁

(廣東醫科大學基礎醫學院生理學教研室，廣東 東莞 523808)

藥物的開發是一個非常復雜、昂貴和耗時的過程，由于安全性和有效性問題，絕大多數的藥物在臨床試驗中失敗。發育毒性指外源物在個體發育為成體的過程中誘發的有害影響，主要表現在發育生物體死亡、生長改變、結構異常及功能缺陷等方面，可采用發育毒性試驗對發育過程中的生物體毒性進行評估。傳統發育毒性評價體系在哺乳動物體內進行，主要是評價藥物的三段生殖毒性試驗[1]。但隨著動物福利“替代、優化、減少(3R)”原則的大力推廣[2]，體外發育毒性試驗的評估逐漸成為研究關注的焦點。

1997年，歐洲替代方法驗證中心驗證了基于小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)建立的胚胎干細胞試驗(embryonic stem cell test，EST)在體外評估藥物胚胎發育毒性的有效性[3]。EST是利用小鼠ESCs可以定向誘導分化的能力，模擬早期胚胎的發育進程，進而觀察藥物對胚胎發育的影響及可能機制。與體內非臨床研究實驗相比，EST具有不需要使用實驗性動物的優點。但因存在種屬差異的問題，藥物對小鼠ESCs的發育毒性不能完全反映人類的疾病病理及機制。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)來源于表達特殊多能基因的成熟已分化細胞，與ESCs非常相似，不僅包括細胞形態、生長特性、ESCs標記基因表達等方面，還體現在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質狀態、形成嵌合體動物等方面[4]。人iPSCs(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)成功避開了人ESCs面臨的倫理和法律問題，可代替人ESCs作為一種新的體外發育毒性評價模型。現就hiPSCs發展的基本信息及其在心肌毒性、肝毒性和神經毒性研究中的應用予以綜述。

1 iPSCs概述

iPSCs通過轉錄因子基因的異位表達，使體細胞重編程形成類似ESCs的成熟細胞。2006年，Takahashi和Yamanaka[5]從24個轉錄因子中篩選出OSKM——八聚體結合蛋白4(octamer-binding protein 4，Oct4)、SRY相關高遷移率族基因2(SRY-related high mobility group-box gene 2，Sox2)、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，Klf4)、骨髓細胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)，并通過逆轉錄病毒載體將4個基因導入小鼠的皮膚成纖維細胞中，使該體細胞重編程獲得類胚胎干細胞樣細胞。隨后，應用相同的方法，hiPSCs由成人皮膚成纖維細胞產生[6]。為了提高重編程效率以及避免畸變形成，研究人員使用了不同的轉錄因子組合如OSNL(Oct4、Sox2、Nanog、RNA結合蛋白Lin28)，OSML(Oct4、Sox2、c-Myc、RNA結合蛋白Lin28)，OSK(Oct4、Sox2、Klf4)等重組體細胞，轉錄因子也從4個減至2個甚至1個(如O、OS)[7]。然而，轉錄因子的導入以病毒為載體，對于細胞后期的使用可能存在安全隱患。因此，研究者利用重組蛋白誘導技術或基于高含量化學熒光法篩選出的代替轉錄因子的小分子化合物成功誘導出iPSCs[8-10]，這些方法誘導產生的iPSCs不再依賴于基因導入，更具有安全性。

iPSCs是可再生的種子細胞，不僅能提供豐富的細胞來源，還可以分化成不同類型的成體細胞。目前，iPSCs已被證實可分化成心臟實質細胞、運動神經細胞、分泌胰島素的胰島成熟細胞和肝細胞等[11-16]。具有沿著特定譜系分化特性的iPSCs使細胞發育和特異性方面的毒性研究成為可能，對于心臟毒理學、肝毒理學以及神經毒理學等研究，iPSCs在促進藥物開發以及提高藥物安全性的體外系統方面提供了巨大的機會，因此在發育毒性替代模型的研究中日益受到關注。

2 hiPSCs在心臟發育毒性方面的應用

因原代人心肌細胞的缺乏，hiPSCs來源的心肌細胞(human induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes，hiPSC-CM)被視為一種強有力的替代來源。針對hiPSCs向心肌細胞的分化，前期研究人員主要采用擬胚體形成法、內胚層細胞共培養法以及生長因子誘導法獲得心肌細胞，但是這些方法存在低效性、異質性高的問題。使用高特異性糖原合酶激酶-3抑制劑CHIR99021、Wnt應答抑制劑IWR等小分子調節Wnt/β聯蛋白信號，并結合流式細胞儀、免疫熒光技術篩選，使hiPSCs高效產生心肌細胞，且具有重復性[17-18]。為了進一步實現心肌細胞的成熟，研究人員通過優化微流系統，采用循環搏動血流動力學來調節細胞微環境，促進hiPSC-CM的成熟，與靜態培養相比，此系統培養的hiPSC-CM具有更強的收縮性[11]。Branco等[12]在小分子調節信號途徑基礎上建立了hiPSC-CM 三維平臺，結果表明，與二維平臺相比，三維心臟分化更能促進hiPSC-CM結構和功能上的成熟。

hiPSC-CM具有可重復性和大規模生產特點，有希望成為具有廣闊應用前景的心臟發育毒性評價模型。與傳統EST相似，可通過檢測藥物對hiPSCs分化為心肌細胞的抑制程度以及對心肌細胞形態與活力的影響評價藥物發育毒性，還可不斷嘗試在細胞生理功能、心肌細胞標志物等方面進行評估。多樣化指標的探索有助于提高hiPSCs在心臟發育毒性評價應用方面的準確性及有效性。

2.1心肌功能 用iPSCs誘導分化的心肌細胞評價藥物的心臟毒性逐漸受到關注。機體心肌細胞的主要功能為搏動射血，體外培養的心肌細胞在顯微鏡下可見跳動。傳統EST通過對跳動心肌細胞進行計數判別藥物對細胞分化的抑制程度，但是這種形態方法比較主觀，受到觀察者經驗的限制。測量hiPSC-CM鈣通量可以間接準確地反映心肌細胞的搏動頻率，將體外高通量篩選模型與成像技術結合對已知體內毒性藥物進行心臟毒性評價，可以較精確地檢測藥物引起的心臟功能異常[19-21]。

心肌細胞是可興奮細胞，即能夠產生動作電位，通過興奮-收縮偶聯使心肌細胞跳動并發揮功能，動作電位的產生涉及眾多通道的開閉，其中人類快速延遲性整流性鉀通道基因編碼的通道在心臟動作電位復極中起至關重要作用，其特征為相對緩慢的激活以及異常快速和電壓依賴性的失活[22]。人類快速延遲性整流性鉀通道是心臟毒性藥物的作用靶點，藥物作用后，出現人類快速延遲性整流性鉀通道阻斷、QT間期延長及尖端扭轉型室性心動過速，表現為劑量和時間依賴性心律失常[23-24]。因此，檢測藥物對心肌細胞離子通道或動作電位的影響也可反映藥物的發育毒性。

2.2心肌損傷標志物 藥物作用于心肌細胞后，細胞內會產生相應心臟毒性的生物標志物，如細胞代謝物、微RNA(microRNA，miRNA/miR)以及特定基因的表達。心肌細胞內的代謝變化可用來評估藥物的心臟毒性，阿霉素暴露于hiPSC-CM后，心肌細胞內產生的丙酮酸、乙酸、甲酸等代謝物可作為與阿霉素類似藥物誘發心臟毒性的代謝標志[25]。另外，Palmer等[26]通過檢測經多種藥物處理后的hiPSC-CM培養基的代謝成分，確定了代表不同代謝途徑的4種代謝物(花生四烯酸、乳酸、2′脫氧胞苷和胸苷)，其可作為評價多數藥物心臟毒性的標志物。

miRNA在心臟病理診斷以及預防中發揮重要作用，其表達水平及分布的改變與各種心血管疾病和心臟組織損傷有關。當阿霉素或環孢素A等藥物暴露于心肌細胞時，細胞內miRNA的表達失調，如miR-182、miR-34、miR-1303及miR-377的表達上調，miR-1303、miR-4298的表達下調，導致DNA損傷、氧化應激與凋亡等心臟毒性的發生[27-29]，表明心肌細胞中表達失調的miRNA可作為心臟毒性生物標志物，用于篩選具有類似作用機制的心臟毒性藥物。

此外，對藥物誘發心臟毒性的基因組生物標志物的鑒定，也可用于評價藥物心臟發育毒性。當阿霉素和相關蒽環類藥物作用hiPSC-CM后，蛋白質和信使RNA水平上的心肌細胞死亡受體的表達顯著上調以及維持離子穩態和線粒體相關功能(如氧化代謝、ATP合成)特征基因的表達下調[30-32]，表明鑒定出的基因組可以預測與蒽環類作用機制相似藥物的心臟毒性。因此，各種心臟毒性生物標志物的識別將有利于藥物心臟發育毒性的大規模篩選。

目前藥物安全篩選方法可確定一些心臟毒性候選藥物，但不能準確反映人類心臟的基因組學、轉錄學以及患者特定心臟毒性等[33]。hiPSC-CM作為一種功能強大且不斷發展的技術，能夠再現人類心肌細胞的許多特性及其藥物反應，因此進一步深入研究心肌功能參數及心肌標志物能有效提高hiPSCs在心臟發育毒性評價中的應用。

3 hiPSCs在肝臟發育毒性方面的應用

人類原代肝細胞是臨床前毒理學篩選的金標準，但這類細胞的表型不穩定且生物特性可變，以致使用受限[34]，因此，亟須發現表型穩定且具有肝細胞特性的無限細胞系。hiPSCs來源肝細胞(human induced pluripotent stem cells-hepatocytes，hiHEP)呈現出類似肝組織的表型，具有一致且無限的可用性，并且可建立不同個體基因型特異細胞[35]。hiPSCs誘導分化為hiHEP的過程主要包括內胚層誘導、成肝細胞形成和肝細胞成熟階段，以此發育進程為基礎的各種誘導分化方案隨之出現，主要有擬胚體形成法、外源性生長因子或小分子物質的添加、轉基因方式的誘導、共培養方式的誘導。為了避免不完全細胞成熟和肝表型分化后的損失，人們探索了不同的策略來優化分化方案。最新研究表明，改變小分子miRNA的表達水平以及減輕細胞內的內質網應激反應可促進hiPSCs向肝細胞樣細胞的分化、增加肝標志物表達以及維持肝臟本身的特性[36-37]。此外，以模擬體內肝臟發生環境的三維hiHEP/內皮細胞聚集體更能促進hiHEP成熟，且hiHEP的尿素產生、糖原合成以及細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)的代謝活性也明顯高于在二維培養條件下產生的hiHEP[13]。由hiPSCs分化的hiHEP所具有的特性使其成為一種有價值的體外肝臟毒性評估模型的細胞來源。除肝細胞核形態、細胞平均面積和整合面積、細胞骨架完整性等基本形態特征外[35,38]，還可根據以下檢測指標評估hiHEP體外藥物發育毒性。

3.1肝臟損傷標志物 miRNA參與基因表達的調控，其表達在幾乎所有急性和慢性肝病中均有特異性的改變，可作為體外藥物所致肝毒性的橋接生物標志物。利用肝毒性藥物對miRNA在肝細胞毒性方面的應用及敏感性的研究表明，細胞中的miRNA可作為藥物誘導肝細胞毒性的特異性標志物[39-40]。此外，miRNA在藥物誘導的肝毒性中也起著重要的調控作用。微囊藻毒素LR是導致原發性肝癌高發的危險因素之一，可改變肝細胞中的miRNA表達譜，使miRNA在微囊藻毒素LR誘導的肝細胞毒性中起重要的負調控作用，且miRNA的表達變化可改變S期肝細胞周期群體數量，從而影響肝細胞的增殖[41-42]。與目前用于肝臟損傷的生物標志物相比，miRNA的敏感性和特異性更好，miRNA作為識別、預防及治療肝臟疾病的靶點，為體外藥物肝發育毒性的檢測提供更廣闊的機會。

CYP450是肝臟和其他組織內質網中最重要的誘導酶。藥物通過細胞內調節許多內源性功能和信號通路的核受體誘導CYP450，從而被CYP450轉化為高活性代謝物，影響代謝途徑的毒性動力學，造成一系列基本的細胞功能失調，如活性氧類過度產生、呼吸鏈功能障礙、細胞應激、谷胱甘肽耗竭等。過量活性氧類和活性代謝物的產生可能因CYP450的過表達導致肝毒性，因此，CYP450可能是接觸外源物的生物標志物，其誘導表達可能是肝臟毒性產生的第一個警報[43-44]。如CYP3A4介導的生物活化已被證實是呋喃類化合物防己苦素誘導肝毒性的潛在機制[45]。因此，肝臟損傷標志物的識別將促進藥物大規模篩選，利于藥物肝臟發育毒性的評價。

3.2氧化應激 氧化應激反應是藥物造成肝臟發育毒性的重要機制之一。細胞防御氧化應激轉錄因子核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)是各種疾病，特別是氧化應激引起的疾病中所必需的。當藥物暴露于細胞時，Nrf2從細胞質進入細胞核，與抗氧化反應元件結合，激活下游靶基因，誘導各種基因表達水平的改變，可反映hiHEP氧化應激的水平[46-47]。同時，藥物作用hiHEP產生的代謝物會造成細胞內谷胱甘肽的耗竭以及活性氧類的積累，引起氧化應激水平的增高。Wang等[48]基于人肝細胞驗證了可通過提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶活性以及增強細胞核中Nrf2的表達來減輕藥物誘導的肝毒性。因此，在hiPSCs向肝臟分化過程中，可通過檢測反映氧化應激水平的指標(如谷胱甘肽和活性氧類含量以及特定基因表達)來評估藥物肝臟毒性。

3.3內質網應激 內質網是合成甾醇和磷脂的主要場所，存在許多參與脂質代謝的酶和調節蛋白。脂質積聚是肝臟脂肪變性的標志，主要受內質網應激信號通路的調控。當高水平飽和脂肪酸和錯誤折疊蛋白改變內質網穩態時，內質網應激信號通路觸發，脂質代謝中基因的表達改變，從而誘導肝臟脂肪變性[49]。棕櫚酸通過介導內質網應激反應造成肝細胞活力的損害并干擾了細胞內的脂質代謝，引起肝細胞凋亡，而油酸則是通過抑制內質網應激改善棕櫚酸誘導的肝細胞脂毒性[50]。另外，內質網應激可能作為極低密度脂蛋白受體表達的驅動因素，促使極低密度脂蛋白的分泌，進而導致細胞內肝臟脂質的累積。Parafati等[51]在內質網應激的誘導下，以不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸處理hiHEP，表明在沒有細胞凋亡的情況下，內質網應激使hiHEP細胞內的脂質積累增加了5倍。肝脂肪變性是可逆的代謝失調狀態，它的發生與內質網應激反應存在緊密的聯系，通過檢測細胞內內質網的穩態水平可反映藥物對肝細胞的脂毒性。

總之，雖然hiHEP并不等同于原代肝細胞，但它們獲得了足夠程度的肝表型，可用于肝毒性研究，并且為探討遺傳性肝病的發病機制以及預測患者對藥物的特定治療或毒性反應提供了新見解。

4 hiPSCs在神經發育毒性方面的應用

hiPSCs的使用為人類神經細胞提供了穩定和可再生的來源。迄今為止，hiPSCs已經分化出各種類型的神經細胞，包括運動神經元、星形膠質細胞、視網膜神經節細胞等。在定向分化中，hiPSCs向神經功能細胞的分化大致均經過了神經祖細胞這一階段，向此階段分化的方法主要有擬胚體形成法、貼壁培養法[52-53]。隨著分化技術的不斷提高，可通過優化氧氣張力、pH和細胞密度等微環境調節劑，使hiPSCs更有效地進行神經細胞分化，且誘導分化方案逐漸從二維轉移到三維，三維神經誘導模型不僅增加了神經細胞的產量，形成具有較長神經突的神經元，并能夠概括神經元-神經膠質的相互作用[15-16]。

hiPSCs來源的神經細胞可以為昂貴、耗時、有倫理爭議的動物實驗或體外原代培養提供一種替代方法，具有廣闊的應用前景。神經細胞的活力和形態變化的可評估性是藥物神經發育毒性評價的活躍研究領域，可通過檢測神經突出生長及分支情況、細胞數量與活性、線粒體密度等指標來研究受試物的神經毒性[54-56]。此外，還可根據以下檢測指標評估體外神經發育毒性。

4.1神經元功能 鉀通道是控制多數神經元興奮性的基礎，負責設置靜息電位、降低興奮性、控制動作電位的持續時間、形狀和發射頻率等。其中，電壓依賴性鉀通道Kv7/M廣泛表達于中樞神經系統和外周神經系統[57]，其穩定的M電流可以抑制神經元的持續性興奮，在神經元興奮性調節中起著關鍵作用，是開發神經元、心血管和代謝疾病新藥物的重要藥理靶點。乙酰膽堿激動M型膽堿受體(M受體)的激活對M電流有強烈的抑制作用，從而導致興奮性增加，降低動作電位閾值，增加去極化和去極化軸突靜息電位[58-59]。hiPSCs源性神經元是一種有用的基于人類細胞的分析方法，可用于體外檢測，通過激活M受體或抑制Kv7/M通道影響神經元興奮性和誘發癲癇發作[60-61]。

4.2氧化應激 氧化應激是由多種外源物誘導并在毒性早期階段確定的細胞非特異性反應，是引起神經發育毒性的重要機制之一。藥物暴露于hiPSCs分化形成的神經細胞后，細胞內表現出高水平的活性氧類和線粒體功能障礙，進而導致神經細胞的死亡或神經發育系統的損傷[62-64]。Nrf2信號通路在細胞抗氧化防御機制的調控中起核心作用，其通路的激活是氧化應激的生物標志。檢測Nrf2信號通路在hiPSCs來源神經細胞模型中的表達，可為通過誘導氧化應激起作用的潛在神經毒性化合物體外篩選和檢測提供依據[65-66]。因此，可通過檢測hiPSCs向神經細胞分化過程中的氧化應激水平指標(如谷胱甘肽和活性氧類含量以及特定基因)的表達評估藥物神經發育毒性。

4.3miRNA miRNA是關鍵的發育調控器，miRNA譜較全基因組譜具有更強的細胞事件預測能力。miRNA在大腦中高度富集，通過調節發育時間、神經干細胞分化和增殖、突觸形成和腦形態發生，在腦發育中發揮重要作用[67-68]。miRNA的異常表達已被證明與多種藥物(麻醉劑、丙戊酸鈉、錳等)誘導的發育神經毒性疾病有關，表明基于miRNA的信號轉導可能是預期藥物神經毒性的新靶點[69-72]。Zhang等[71]發現，長期暴露于麻醉藥物的發育中大腦神經細胞內的miR-132表達水平顯著上調，布比卡因與胰島素樣生長因子-1受體進一步結合可促進神經細胞凋亡和神經毒性，表明miRNA在調節藥物誘導的神經毒性中起重要作用，是治療藥物神經毒性的一個有前途的分子靶點。

雖然hiPSCs衍生的神經發育毒性模型還不能完全模擬復雜的大腦系統，但通過對神經功能及標志物等多方面的評估，hiPSCs衍生的神經細胞可為體外藥物發育毒性的高通量篩選提供新模型。

5 小 結

hiPSCs獲得方法相對簡單、穩定，在技術和倫理方面具有明顯優勢，目前已被廣泛應用于多種研究，包括疾病模型、再生醫學、藥物研發和藥物毒性等。以干細胞為基礎的胚胎毒性研究實驗主要用于檢測外源化學物質的細胞毒性及胚胎發育毒性。iPSCs的產生為針對性疾病的研究以及新療法藥物的開發篩選提供了可能，可代替ESCs建立體外模型來評價受試物的發育毒性。然而，iPSCs是否與ESCs具有相同的分化潛力仍存在爭議；且由于條件和技術尚不完全成熟，iPSCs在體外的分化機制不能等同體內的胚胎細胞發育，體外的培養條件也難以完全模擬體內胚胎的生長環境[73]。此外，從體細胞衍生的iPSCs可能已經被老化、化學或環境預暴露所改變，這種表觀啟動表型能否在重編程后逆轉仍有待證明。

總之，以hiPSCs為基礎的高含量篩選方法在藥物發育毒性評價方面已獲得越來越多的關注。iPSCs的應用在技術方面還存在諸多不足，但隨著研究的不斷深入，更多的檢測指標將被發現，且可與流式細胞技術、細胞集落分析、實時無標記細胞分析技術、熒光顯微分析等靈敏檢測技術相結合。iPSCs作為理想的種子細胞，相信未來會在體外藥物發育毒性評價方面發揮重要作用。