基于組成型抗性性狀的油茶抗茶籽象的評價模型*

張守科 方林鑫 王 毅 張 威 舒金平 汪陽東 王浩杰

(1. 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所 杭州 311400； 2. 中國林業科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室 北京 100091； 3. 青田縣林業局 青田 323900)

長期以來，病蟲害是造成作物損傷乃至減產的關鍵因素，培育并推廣抗病蟲品種是治理病蟲害最根本、最經濟有效的手段，抗病蟲育種一直是育種研究的重要內容(吳元奇， 2001)。構建有效的抗病蟲評價模型以評估不同品種的抗病蟲能力，對于新品種的選育和應用有著重要意義。

育種工作中品種表型穩定性是評價品種優良程度的重要指標。植物抗性分為誘導性抗性和組成型抗性兩大類(張蓬軍， 2007； 李新崗等， 2008； 謝輝等， 2012)，抗病蟲品種表型的篩選往往聚焦于植物組成型抗性性狀。組成型抗性是植物固有的、基因決定的包括植物自身形態結構和生理生化等方面的抗性(Karbanetal.， 1997； 桂連友等， 2004)。植物組成型抗性主要受基因控制，不因一時環境因素改變而影響其抗性品質，在植物寄主體內始終發揮作用(孟昭軍， 2008)，在抗性品種選育中更具優勢。植物抗蟲不單單靠一個防御系統，有時是多系統聯用來抵御害蟲。植物在植食性昆蟲危害的選擇壓下進化出各種抗性策略，表現為化學性狀(驅避性揮發物、有毒次生代謝物質積累等)及物理性狀(果皮/葉片厚度、硬度等)的改變(Myersetal.， 2017)，而植食性昆蟲在此進程中與植物形成了“軍備競賽”式的協同進化關系(Tojuetal.， 2011)。因而，植物抗性評價模型的構建需要考慮多抗性指標聯合才可提升模型的精度和準度(吳元奇， 2001)。

油茶(Camelliaoleifera)是我國目前主栽的木本油料作物之一，在南方山地經濟發展中占據重要地位。因其產油率高、油品質量好等因素與油橄欖(Oleaeuropaea)、油棕(Elaeisguineensis)、椰子(Cocosnucifera)并稱為世界四大木本油料(姚小華等， 2012)。隨著我國油茶產業的迅猛發展，油茶種植面積不斷擴大，集約程度不斷提高，油茶病蟲害也隨之發生，其中茶籽象(Curculiochinensis)(鞘翅目Coleoptera： 象甲科Curculionidae)最為嚴重。茶籽象是油茶最為主要的種實害蟲，以成蟲和幼蟲危害茶果，造成大量落果，嚴重影響茶果產量和茶油品質。茶籽象危害隱蔽，一旦錯過成蟲羽化產卵的關鍵防治期，防治十分困難(舒金平等， 2013； 何立紅等， 2014； 張守科等， 2019)。當前，茶籽象的防治仍依賴化學防治，但農藥防治效果差而且有農藥殘留問題，食品及生態安全風險大，因此，篩選抗蟲性好、產油率高的無性系極為迫切。近年來，山茶屬(Camellia)植物抗病蟲研究僅茶樹(C.sinensis)開展了一些誘導性抗性研究(Zhuetal.， 2019)，對于組成型抗性的研究較少(李榮林等， 2015； 趙豐華等， 2015； 金珊等， 2016； 鐘明躍， 2018)，而對于油茶抗蟲組成型抗性性狀的研究尚未開展，以至于對油茶不同品種的抗蟲性評價尚未有統一標準(何立紅等， 2014； Zhangetal.， 2020)，因此構建基于多個組成型抗性性狀參與的抗性評價模型對于油茶抗性育種有著重要的參考價值。

本研究以山茶屬植物抗茶籽象研究試驗驗證的3種抗性指標(果形指數、果皮厚度、關鍵時期茶皂素積累量)作為依據(Zhangetal.， 2020)，以普通油茶無性系作為研究對象，長時間尺度調查茶籽象為害率，通過逐步回歸分析，確定普通油茶抗茶籽象關鍵組成抗性性狀，并初步構建抗性評價模型，為油茶新品種抗茶籽象與否提供判斷依據，并為我國油茶抗蟲育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗地及油茶試驗林概況

試驗地分別位于江西省新余市分宜縣長埠實驗林場油茶種質園(27°57′28″N，115°04′11″E，海拔156 m)、浙江省青田大尖山油茶種植園(28°27′32″N，120°16′48″E，海拔432 m)。2處試驗地均屬于亞熱帶季風氣候，均為油茶純林，油茶林基本處于無人為噴施農藥防治病、蟲、雜草的自然狀態，林下分布芒萁(Dicranopterispedata)、杠板歸(Polygonumperfoliatum)及禾本科(Poaceae)狗牙根(Cynodondactylon)、白茅(Imperatacylindrica)等雜草。長埠實驗林場油茶種質園油茶樹齡15 ～ 20年，種植長林系列多個無性系且無性系間混種，均有結實，周圍有柑橘(Citrusreticulata)林分布。大尖山油茶種植園油茶樹齡10 ～ 15年，主栽長林系列多個無性系且無性系間混種，均有結實，周圍無其他樹種分布。自2016年，本研究選取我國主栽的長林系列普通油茶8個高產優質無性系(長林3號、長林4號、長林18號、長林22號、長林40號、長林53號、長林55號、長林166號)作為抗性評價模型構建的樣本無性系，連續4年不間斷觀測其生長狀況、結實規律及茶籽象危害情況。

1.2 茶籽象為害率調查

于2016—2019年，每年9月下旬茶果采摘前，對選定的油茶8個無性系進行隨機采樣。每一個無性系隨機選擇5株樣株，每株分為上、中、下3個層次，東、南、西、北4個方位，每個層次每個方位隨機摘取20個茶果，每株共計240個茶果，不足240個的植株則全部采摘。將2處搜集的茶果按照無性系編號帶回杭州市中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所養蟲室，放置于室溫環境下，任老熟幼蟲自由逸出茶果，統計老熟幼蟲數量。待11月底，如持續7天未記錄到幼蟲逸出，則認定該無性系茶籽象已經完全老熟逸出。按照為害率公式(李苗苗等， 2016)： 為害率(%)=(茶籽象逸出孔數/油茶果個數)× 100%，統計不同無性系的受害率。

1.3 果形指數及果皮厚度測定

于2016—2019年，每年5月下旬茶籽象產卵高峰期時，在2塊試驗地內采集茶果，采樣方法同1.2。將采集的幼嫩茶果使用游標卡尺測定果長(a)、果寬(b)、果高(L)，按照公式： 果形指數=(a+b)/2L，分別求得8個油茶無性系果形指數(李青等， 2012； 何立紅等， 2014)。果皮厚度的測定按照果實基部、中部、端部3處厚度平均值作為一個茶果的果皮厚度。每個無性系隨機選取5株，每株240個果子，共測定1 200個茶果。

1.4 茶籽象發育關鍵期油茶種子中茶皂素含量測定

1.4.1 樣品準備 基于前期對茶籽象對長江中下游地區山茶屬(Camellia)植物的危害規律的調查(Zhangetal.， 2020)，山茶屬植物種子茶皂素含量變化與茶籽象幼蟲發育時間密切相關，茶籽象幼蟲的發育可分為產卵高峰期(5月下旬—6月上旬)、初孵幼蟲期(6月中旬—6月下旬)、幼蟲發育期(7月上旬— 8月中旬)和幼蟲成熟期(8月下旬— 9月下旬)4個階段。2016—2019年，在這4個關鍵時期分別進行茶果樣品采集，采集方法同1.2，但每個層次每個方位僅隨機摘取5個茶果，每株共計60個茶果； 將茶果放置于4 ℃冰箱內，帶回實驗室后將種仁剝出置于 -20 ℃冰箱內冷凍保存供試。每個無性系隨機選取5株，每株60個茶果的種仁作為一個樣品，共5個重復。

1.4.2 茶皂素含量測定 參考Zhang(2016)的方法測定茶皂素含量。色譜預處理條件如下： 色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18(安捷倫科技公司)(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶水(體積比9∶1)； 檢測波長為210 nm； 柱溫25 ℃。標準處理： 準確稱量茶皂素標準品0.5 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇超聲溶解，體積為100 mL，分別取1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，置于5 個50 mL體積的容量瓶中。0.45 μm微孔膜過濾。標準曲線以質量濃度作為橫坐標和對應的峰面積作為縱坐標計算繪制。樣品中茶皂素含量測定： 稱取樣品0.058 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇超聲溶解，定容于50 mL容量瓶中。0.45 μm微孔膜過濾。每個樣品5個重復。按公式計算茶皂素含量，茶皂素含量(%)=X×V/m× 100%，式中：X為樣品溶液濃度(g·mL-1)，V為定容體積(mL)，m為樣品質量(g)。

1.5 數據統計分析及模型構建

利用SPSS 20軟件對8個油茶無性系間茶籽象為害率、果形指數、果皮厚度及4個時期茶皂素含量等數據進行ANOVA單因素方差分析。并利用Graphpad繪圖軟件繪制小提琴散點圖及進行方差分析。基于果形指數數據，利用R語言kmean()函數進行8個無性系聚類分析(湯銀才， 2008)； 并利用R語言中ggplot2包中geom_ribbon()函數繪制基于果形指數分布的峰巒圖直觀展示8個無性系果形指數分布狀況及聚類情況。利用網絡在線繪圖工具(https:∥www.omicshare.com/tools/Home/Soft/heatmap)繪制不同時期茶皂素含量變化熱圖(Zhangetal.， 2020)。回歸模型的構建采用R語言中MASS包中的stepAIC()函數(汪海波等， 2018)，利用果形指數(X1)、果皮厚度(X2)、4個時期的茶皂素含量(X3-6)、茶籽象為害率(Y)，依據精準AIC準則進行逐步回歸分析，篩選出與Y最為相關的X值帶入模型。

2 結果與分析

2.1 茶籽象對8個油茶無性系的為害率

4年間對油茶長林系列8個主推無性系茶籽象為害率的追蹤調查發現，長林3號(46.02% ± 0.02%)和長林18號(37.30% ± 0.02%)4年受害率維持較高(圖1)； 而長林166號受害率為35.33% ± 0.01%，在選取的8個無性系中處于中間類型； 其余長林4號、22號、40號、53號及55號彼此之間受害率差異不大(P>0.05)，維持在20%左右，與長林3號、18號、166號差異顯著(P<0.05)(圖 1)。4年內長林22號的受害率極大值(30%)與極小值(12%)差異最大，長林55號極值變異最小(圖 1)。

圖2 油茶8個無性系的果型指數差異Fig.2 The difference of capsule-shape indexes among 8 clones of Camellia oleifera

圖1 茶籽象對油茶8個無性系的為害率Fig.1 Damage rate of Curculio chinensis to 8 clones of Camellia oleifera不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05)。下同。The bar marked with different lowercase letters is significantly different at the level of P<0.05. The same below.

2.2 茶籽象產卵高峰期8個油茶無性系的果形指數

茶籽象產卵高峰期，8個油茶無性系的幼果果形指數存在顯著差異，差異主要來自無性系分組組間(F=1 766.98，P<0.001)。從聚類樹來看，可以分為4個大的類群： 長林3號和55號； 長林4號、22號、40號和53號； 長林166號； 長林18號(圖 2)。其中，長林18號和22號果形指數接近于1，幼果近圓形； 且長林18號幼果發育更為統一，大多數幼果果形指數差異不大，密集聚集于0.9 ～ 1之間，極值之差為0.06(圖 2)； 而長林22號果形指數極大值1.04，極小值0.96，且較為均勻地分布于0.96～1.04之間(圖 2)。8個無性系中，長林166號的果形指數變異最大，極值之差為0.18，所有果形指數處于0.51 ～ 0.69之間，果型為橢圓形。其他無性系介于長林166號與長林18號和22號之間，果形指數差異不大(P>0.05)(圖 2)。

2.3 茶籽象產卵高峰期8個油茶無性系的果皮厚度

茶籽象產卵高峰期，8個油茶無性系果皮厚度差異顯著，差異主要來自無性系分組組間(F=198.92，P<0.001)。其中長林53號果皮最厚，為(5.03 ± 0.08)mm，長林22號次之，為(4.095 ± 0.07)mm(圖 3)； 長林3號、4號、18號和22號果皮厚度均值均處于4 ～ 5 mm之間，4者存在差異，但僅長林4號與長林22號存在顯著差異(P<0.05)，而從無性系內部變異分析來看，長林18號和22號無性系內極值差(分別為0.18和0.2)均大于長林3號和4號(分別為0.03和0.02)(圖 3)； 長林55號和166號，在茶籽象產卵高峰期平均果皮厚度最薄，處于3 ～ 4 mm，且無性系內極值差也不大，但二者果皮厚度差異顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 油茶8個無性系的果皮厚度差異Fig.3 The difference of pericarp thickness among 8 clones of Camellia oleifera

2.4 茶籽象發育過程中8個油茶無性系種子中茶皂素積累規律

對茶籽象產卵高峰期、初孵幼蟲期、幼蟲發育期、幼蟲成熟期油茶種子中茶皂素積累量進行聚類分析，結果表明，長林22號、40號和55號聚為一支； 長林3號和4號聚為一支； 長林18號、53號和166號聚為一支(圖 4)。4個時期，8個無性系之間茶皂素含量差異都極顯著(P<0.001)，且變異主要來自組間，說明茶皂素含量無性系之間的差異大于無性系內(表 1)。從發育期來看，產卵高峰期長林3號、4號、18號、53號及166號茶皂素含量差異不大(P<0.05)，22號和40號則顯著高于其他無性系(P<0.05)，分別為(3.5 ± 0.35)mg·g-1和(3.4 ± 0.096)mg·g-1； 初孵幼蟲期，長林3號、4號、18號和166號茶皂素含量差異不大(P>0.05)，與長林22號、53號及55號差異顯著(P<0.05)； 幼蟲發育期，長林3號和4號茶皂素含量最低且與其他樣本差異顯著(P<0.05)，長林40號含量則最高； 幼蟲成熟期，長林22號、40號、55號茶皂素含量最高，長林3號、4號最低，長林18號、53號、166號居于中間，且這3組無性系之間的含量差異顯著(P<0.05)(圖 4)。

圖4 油茶8個無性系種子中茶皂素積累規律Fig.4 The accumulation of tea saponin content in seeds among 8 clones of Camellia oleifera

2.5 基于8個油茶無性系的組成型抗性指標構建抗性評價模型

以茶籽象為害率(Y)為因變量，運算開始時模型包含6個自變量(X1： 果形指數；X2： 果皮厚度；X3： 產卵高峰期茶皂素含量；X4： 初孵幼蟲期茶皂素含量；X5： 幼蟲發育期茶皂素含量；X6： 幼蟲成熟期茶皂素含量)，每一次擬合是依據貢獻值排除1個變量，初始AIC=-136.53，隨著變量的依次排除，AIC值發生由-160.21、-163.67、-173.5、-175.86的變化； 且果形指數(X1，P=0.216 9)、果皮厚度(X2，P<0.001)、4個時期的茶皂素積累量(X3，P=0.129 9；X4，P<0.001；X5，P<0.05；X6，P<0.01)6個自變量，模型檢驗結果擬合度較好。但經過偏回歸檢驗分析： 果皮厚度(X2，P=0.072 99)、茶籽象發育后3個時期的茶皂素積累量(X4，P<0.001；X5，P<0.01；X6，P<0.01)4個變量與0有顯著差異，其余變量與0沒有顯著差異。最終基于4個變量進行逐步回歸，構建模型為：Y=0.531 6-0.301X2- 0.436 57X4+ 0.059 526X5- 0.019 4X6，擬合程度好(R2=0.773 7，P<0.01)。

3 討論

林木抗蟲育種研究起步晚，且受限于遺傳轉化體系難構建、育種周期長的劣勢，研究進展一直相對緩慢(萬志兵等， 2012)。在國家倡導生態文明建設推動經濟林產業發展的形勢下，林木抗蟲品種的選育仍然是現階段林木遺傳育種研究的重要內容。選育穩定遺傳的組成型抗蟲表型是抗蟲育種的關鍵(吳元奇， 2001)。植物為了適應植食性昆蟲危害的選擇壓力進化出各種組成型抗性性狀，表現為化學性狀(拒食性揮發物、各種有毒次生代謝物質穩定積累)及物理性狀(厚度、硬度)的改變(Myersetal.， 2017)。

山茶屬植物組成型抗性包括果皮厚度、果形指數、果實絨毛、顏色等物理指標(李榮林等， 2015； 趙豐華等， 2015； 金珊等， 2016)和茶皂素、單寧酸含量等化學指標，可以作為山茶屬植物重點的抗性性狀加以篩選(Zhangetal.， 2020)。山茶屬植物果實多呈圓球狀，針對不同無性系油茶果實測定的果形指數介于0.5 ～ 1.4之間(左繼林等， 2012； 董萬領等， 2013； 李小梅等， 2013)，呈現橢圓形到圓形。何立紅等(2014)在對小果油茶(Camelliameiocarpa)果形指數與茶籽象為害率的研究中發現，果形指數越接近于1即果子越圓為害率越高。本研究對油茶8個長林無性系的果形指數測定基本與何立紅等(2014)結果一致，無性系之間果型變異較大(果形指數在0.5 ～ 1.2之間)，但在多元線性回歸分析中果形指數擬合度不佳，且偏回歸系數與0差異不顯著(P=0.769 4)，構建模型時被舍去。茶籽象幼蟲無轉寄主特性，不同品種油茶受害率與茶籽象成蟲產卵選擇密切相關，因此成蟲產卵期的果形指數可能與茶籽象產卵偏好有關。本研究測定了茶籽象產卵期不同品種的果形指數，但其在回歸擬合時被舍去，說明在茶籽象產卵高峰期果形指數在油茶抗性評價中貢獻不顯著(X1，P=0.216 9)。何立紅等(2014)認為果形指數與茶籽象危害密切相關，其測定的是幼蟲老熟期茶果的尺寸，而本研究是成蟲產卵期的果形指數，結果不一致的原因可能與取樣時間不一致有關。

植物表皮組織加厚，是抵御昆蟲危害的一種適應機制。不同茶樹(Camelliasinensis)種質對黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)的抗性隨著葉片海綿組織增厚而表現抗性增強(王慶森等， 2009)； 沙棘(Hippophaerhamnoides)樹皮表皮厚度、表皮細胞緊密程度等與抗沙棘木蠹蛾(Holcocerushippophaecolus)有顯著相關性(趙延霞等， 2012)； 在日本山茶(Camelliajaponica)與日本山茶象(Curculiocamelliae)協同進化關系的研究中也發現類似規律，象甲喙的長度與茶果果皮厚度關系密切(Tojuetal.， 2005； 2006； 2011； Toju， 2011)。本課題組的前期研究發現，茶籽象喙長約5 ～ 7 mm，而除浙江紅山茶(Camelliachekiangoleosa)(果皮厚度 >8 mm)外大部分山茶屬植物的果皮厚度都在6 mm以下，且我國各地區茶籽象并未形成基于寄主適應的局域種群(Zhangetal.， 2018； 2019)，因此基于最優覓食理論(Charnov， 1976)及山茶屬植物果皮厚度與茶籽象為害率的關系分析推測，果皮厚度可能是阻礙茶籽象產卵的重要屏障，果皮厚度增加了雌性茶籽象的取食、產卵難度。從本研究中的8個油茶無性系茶籽象產卵高峰期果皮厚度測定結果來看，不同無性系之間果皮厚度存在明顯差異，且多元線性回歸模型中果皮厚度擬合度高且顯著(P<0.001)，但偏回歸系數與0差異顯著性較低(P=0.769 4)，果皮厚度在模型中貢獻權重僅次于初孵幼蟲期茶皂素含量。

植物能穩定表達產生對害蟲有毒、抗營養和難消化的次生代謝化合物直接殺傷昆蟲或降低昆蟲對食物的消化能力，使昆蟲不能獲得足夠的營養，從而可減少或阻止昆蟲的進一步取食，達到直接抗蟲的目的。植物皂苷是一類重要的防御性化合物，包含三萜類和甾體類皂苷。研究表明茶皂苷會刺激小鼠(Musmusculus)腸道黏膜引起毒性病變(Kawaguchietal.，1994)，甾體類皂苷則會引發羊的腸胃疾病，從而降低腸道蠕動，降低食物利用效率導致植食性動物體質量下降(Wisl?ffetal.， 2008)。山茶屬植物可以通過茶皂素抑制茶籽象與營養代謝相關的腸道菌群豐度，進而造成茶籽象發育不良，來發揮抗蟲作用(Zhangetal.， 2020)。油茶8個長林無性系種子中的茶皂素在茶籽象4個發育關鍵時期的積累規律存在明顯差異，其中初孵幼蟲期、幼蟲發育期和幼蟲成熟期茶皂素含量在多元線性回歸模型中占據較高權重且擬合顯著(P<0.001)。產卵高峰期茶皂素濃度在模型擬合過程中由于擬合度不高被舍棄，說明產卵高峰期油茶無性系種子中茶皂素含量低且對雌性茶籽象產卵影響不大，與后期為害率相關性不大。

茶籽象危害是導致茶果采前脫落的重要原因(舒金平等， 2013)，但茶籽象危害導致落果的多少與品種、種植年限、種植條件及氣候等因素均有關系。本研究發現9月下旬在選定的2個試驗樣地內還未出現明顯的蟲害落果現象和幼蟲逃逸現象，這可能與本研究中調查的對象均是栽種時間不長的新品種林且種植及管理情況良好有關。但在落果較早且較為嚴重的油茶種植區，選擇7月中、下旬進行茶籽象為害率的調查可能更為準確。

4 結論

茶籽象是我國油茶產業健康發展的重要威脅性蟲害。本研究基于油茶長林無性系組成型抗性性狀測定，并采用多元線性回歸模型綜合分析果形指數和果皮厚度以及茶籽象4個為害關鍵期油茶種子中茶皂素含量與茶籽象為害率的關系，初步構建了以茶籽象為害率為因變量、以果皮厚度及茶籽象初孵幼蟲期、幼蟲發育期和幼蟲成熟期油茶種子中茶皂素含量為自變量的油茶抗茶籽象評價模型。模型的構建可為油茶新品種對茶籽象的抗性評價提供依據，為我國油茶品種的抗病蟲選育提供新思路。