平菇多糖硫酸酯制備工藝優化及抗氧化活性研究

梁 英 畢紅梅 鄭文鳳 畢洪梅 李志江

(1.黑龍江八一農墾大學理學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

平菇又稱白蘑，學名側耳，屬擔子菌門下傘菌目側耳科，是藥食兩用菌。平菇易于栽培，營養豐富且富含多糖[1]，是獲取多糖物質的極好原料。據報道[2-4]，平菇多糖(Pleurotusostreatuspolysaccharides，POP)具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂和免疫調節等多種生物活性。但因水溶性較差，其生物活性的發揮受到了一定的限制。對多糖進行化學修飾，可有效地改變多糖的化學結構，從而改變多糖的理化性質，提高其生物活性[5]。天然多糖硫酸酯和化學修飾后的多糖硫酸酯是目前研究較多的一大類多糖，硫酸酯化是多糖改性的最常用方法，已成為近年來研究的熱點，受到很多學者們的極大關注[6-8]。研究表明，多種食用菌多糖經硫酸化修飾后，不但提高了原多糖的水溶性，其抗氧化[9-11]、抗腫瘤[12-13]、抗病毒[14]、抗凝血[15]、降血脂[16]、保護神經細胞[17]等作用也明顯增強。近年來，對多糖硫酸酯的合成、表征和生物活性的研究促進了多糖硫酸酯在食品工業和醫藥領域的應用[18]。但對平菇多糖硫酸酯的制備及生物活性研究中國未見報道。

研究擬以從平菇子實體中提取的平菇多糖為原料，采用濃硫酸法對平菇多糖硫酸酯的制備工藝進行優化，鑒定平菇多糖硫酸酯的結構并考察其抗氧化活性。旨在為平菇多糖硫酸酯在藥物和抗氧化保健功能性食品的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

平菇多糖：純度為87.56%，實驗室自制；

無水乙醇、濃硫酸、正丁醇、硫酸鉀、三氯化鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚、抗壞血酸、水楊酸、過氧化氫：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

三羥甲基氨基甲烷：生化試劑，美國Sigma公司；

DPPH：分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：ALC-310.3型，上海精密科學儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE-5299型，鞏義市黃山谷予華儀器廠；

紫外分光光度計：T6新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：Nexus 670FT-IR型，美國Thermo Nicolet公司；

離心機：LXJ-IIB型，上海安亭科學儀器廠；

恒溫水浴鍋：HWS24型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 平菇多糖硫酸酯的制備 取一定體積的濃硫酸與5 mL含有0.063 g (NH4)2SO4的正丁醇溶液混合，置于三頸圓底燒瓶中，裝上干燥管和攪拌器，冰浴冷卻到0 ℃，磁力攪拌30 min，緩慢加入1.00 g平菇多糖，在一定溫度下進行反應。反應結束后，離心(3 000 r/min，10 min)分離，殘留物用5% NaAc溶液中和，產物用重蒸水透析24 h，然后加入5倍體積的無水乙醇沉淀，減壓抽濾，用無水CaCl2干燥，得到的白色晶體即為平菇多糖硫酸酯。

1.3.2 平菇多糖硫酸酯制備的單因素試驗設計

(1) 濃硫酸加入量對平菇多糖硫酸酯取代度的影響：固定平菇多糖質量1.00 g、反應時間90 min、反應溫度20 ℃，濃硫酸加入量分別為6，8，10，12，14 mL，按1.3.1進行操作并計算取代度值。

(2) 反應溫度對平菇多糖硫酸酯取代度的影響：固定平菇多糖質量1.00 g、濃硫酸加入量10 mL、反應時間90 min，反應溫度分別為20，40，60，80，100 ℃，按1.3.1進行操作并計算取代度值。

(3) 反應時間對平菇多糖硫酸酯取代度的影響：固定平菇多糖質量1.00 g、濃硫酸加入量10 mL、反應溫度20 ℃，反應時間分別為30，60，90，120，150 min，按1.3.1進行操作并計算取代度值。

1.3.3 平菇多糖硫酸酯制備的正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上確定正交試驗的因素水平，采用L9(34)表進行正交試驗，對平菇多糖硫酸酯的制備工藝進行優化。

1.3.4 考察指標測定

(1) 硫酸基含量的測定及取代度計算：采用BaCl2凝膠法[19]測定硫酸基含量，以K2SO4溶液繪制標準曲線，在360 nm波長下測定吸光度，由回歸方程計算硫酸基含量，再根據式(1)計算取代度。

(1)

式中：

DS——取代度；

S——硫含量，%。

(2) 紅外光譜分析：稱取5 mg的平菇多糖或平菇多糖硫酸酯與適量的KBr壓片，用FT-Iris5型傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波數范圍掃描，得到紅外吸收光譜圖進行分析，確定平菇多糖硫酸酯的合成情況。

(3) 相對還原力：參照文獻[20]，以抗壞血酸作陽性對照，在700 nm處測定吸光度，每個樣品重復3次，取平均值。吸光度越大，還原能力越強。

(4) 超氧陰離子自由基清除能力：采用鄰苯三酚自氧化法[20]，以抗壞血酸作陽性對照，在325 nm 處測定吸光度值，重復3次，取平均值。

(5) DPPH自由基清除能力：參照文獻[20]，以抗壞血酸作對照，在517 nm 處測定吸光度值，重復測定3次，取平均值。

(6) 羥自由基的清除能力：采用Fenton反應體系[20]，以抗壞血酸作陽性對照，重復測定3次，取平均值。

1.4 數據處理

試驗數據處理采用SAS 9.1軟件，結果用(平均數值±標準偏差)表示，P<0.05為差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 平菇多糖硫酸酯制備工藝優化

2.1.1 單因素試驗 由圖1(a)可知，隨濃硫酸加入量的增大，取代度先增加，當硫酸加入量為10 mL時取代度最大(為0.40)，之后開始降低。可能是濃硫酸加入過多，放熱過快造成多糖碳化，同時還會導致多糖部分降解的緣故。因此，濃硫酸最佳加入量為10 mL。

由圖1(b)可知，反應溫度在20～60 ℃時，隨溫度升高，取代度緩慢增加；當溫度為60 ℃時，取代度達到最高，為0.47；當溫度超過60 ℃時取代度明顯降低。說明溫度過高也可造成平菇多糖碳化，不利酯化反應。因此，最佳反應溫度為60 ℃。

由圖1(c)可知，反應初期，隨反應時間的延長，平菇多糖的取代度明顯提高，1.5 h時達最高(為0.42)，之后取代度有所降低。可能是因為濃硫酸的強氧化性及長時間作用引起多糖分子鏈發生斷鏈和脫水焦化等副反應，致使取代度下降[21]。因此，最佳反應時間為1.5 h。

圖1 濃硫酸體積、反應溫度和反應時間對平菇多糖硫酸酯取代度的影響Figure 1 The effects of sulphuric acid volume,temperature and time on the degree of substitution of polysaccharide of Pleurotus ostreatus

2.1.2 正交試驗 在單因素試驗結果的基礎上確定正交試驗的因素水平，見表1。

由表2可知，濃硫酸加入量影響最大，反應溫度次之，影響最小的是反應時間；空列的R值與反應時間的R值相等，可能是因素間存在一定的交互作用所致。優化參數為A2C2D2，即平菇多糖質量1.00 g，濃硫酸加入量10 mL，反應溫度60 ℃，反應時間90 min。按此組參數重復3次驗證實驗，平菇多糖取代度為0.48，高于其他組合，因此優化工藝為平菇多糖質量1.00 g，濃硫酸加入量10 mL，反應溫度60 ℃，反應時間90 min。

2.2 紅外光譜分析

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

2.3 體外抗氧化活性

平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的抗氧化活性試驗結果見圖3。

由圖3(a)可知，在試驗濃度范圍內，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的還原能力與樣品濃度呈正相關，濃度越大，還原能力越強，二者還原能力相當，低于對照組維生素C(P<0.01)。

由圖3(b)可知，質量濃度為0.5～3.0 mg/mL時，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對超氧陰離子自由基的清除能力隨著質量濃度的增加，一直明顯增加。當質量濃度達到3.0 mg/mL時，平菇多糖硫酸酯對超氧陰離子自由基的清除率達到了70.12%；但低于質量濃度為1.5 mg/mL的維生素C的清除率，與維生素C對照組比較差異顯著(P<0.01)。維生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對超氧陰離子自由基的IC50(半數清除率)分別是0.668，2.321，1.882 mg/mL，平菇多糖硫酸酯對超氧陰離子自由基的清除能力好于平菇多糖。

由圖3(c)可知，質量濃度為0.5～1.5 mg/mL時，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對DPPH自由基的清除能力隨濃度的增加極顯著增加(P<0.01)，質量濃度為1.5～>3.0 mg/mL 時，對DPPH自由基的清除能力增強緩慢，差異不顯著；平菇多糖硫酸酯對DPPH自由基的清除能力與對照組維生素C差異不顯著，平菇多糖對DPPH自由基的清除能力與對照組維生素C差異顯著(P<0.05)；當質量濃度為3.0 mg/mL時，平菇多糖硫酸酯、平菇多糖、維生素C對DPPH自由基的清除率分別為85.78%，77.45%，90.23%。維生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對DPPH自由基的IC50(半數清除率)分別是0.523，0.999，0.816 mg/mL，平菇多糖硫酸酯對DPPH自由基的清除能力好于平菇多糖。

圖2 平菇多糖和平菇多糖硫酸酯FT- IR光譜Figure 2 FT-IR absorbance spectrums of POP and POPS

由圖3(d)可知，質量濃度為0.5～3.0 mg/mL時，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對羥基自由基的清除能力隨質量濃度的增加而增大。維生素C對羥基自由基的清除能力在質量濃度為1.5 mg/mL時基本達到最高，隨著質量濃度的增加，維生素C的清除率趨于穩定。當質量濃度為3.0 mg/mL時，平菇多糖硫酸酯的清除率達到了78.42%。當質量濃度為1.5 mg/mL時，維生素C的清除率達到了91.28%，與對照組比較差異顯著(P<0.01)。維生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯對羥基自由基的IC50(半數清除率)分別是0.635，2.083，1.611 mg/mL，平菇多糖硫酸酯對羥基自由基的清除能力好于平菇多糖。

圖3 平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的還原力和自由基清除能力Figure 3 Reductive power and scavenging ability to free radicals of POP and POPS

綜上，平菇多糖硫酸酯對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力均好于平菇多糖，與前人[9-10，22-24]研究結果一致。可能是多糖引入硫酸基后，改變了多糖的水溶性、光學活性和空間構象，從而使其性質有所不同，引起生物活性發生改變[16，22，25]。

3 結論

試驗采用濃硫酸法成功制備了平菇多糖硫酸酯，通過正交試驗獲得了制備優化工藝，即平菇多糖質量1.00 g，濃硫酸加入量10 mL，反應溫度60 ℃，反應時間90 min，取代度為0.48。紅外吸收光譜分析證明平菇多糖是吡喃型多糖。平菇多糖和平菇多糖硫酸酯都具有較好的抗氧化性，但平菇多糖硫酸酯的抗氧化性強于平菇多糖，說明食用菌多糖經硫酸修飾后抗氧化能力增強。綜上，制備平菇多糖硫酸酯的原料來源豐富，工藝簡單，對平菇多糖硫酸酯的批量生產有重要的現實意義，同時平菇多糖硫酸酯的抗氧化性有著較好的應用價值，在藥物和抗氧化保健功能性食品領域會有長遠的發展。平菇多糖硫酸酯的其他生物活性及取代度不同對其生物活性的影響還有待進一步研究。