miR-335-5P 調控的TGF-β 通路介導妊娠糖尿病小鼠胰島素抵抗和胰島β 細胞分泌的實驗研究

劉 潔溫學娜馮 英李元元劉永莉

(1.石家莊市第四醫院產科,石家莊 050011; 2.辛集市第一醫院產科,河北辛集 052360)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)指妊娠期首次發現的胰島素相對、絕對缺乏或胰島素抵抗引起的高血糖臨床綜合征,我國發病率約1%～5%且呈逐年上升趨勢[1]。 多數學者認為GDM 與胰島素抵抗有密切關系,因妊娠期婦女本身存在葡萄糖相對不耐受。 隨著孕期增加、機體對胰島素敏感性增強,孕婦機體不能分泌足夠胰島素來滿足機體需求而引起GDM[2-3]。 GDM 患者體內異常的胰島素抵抗作用可導致體內代謝和生理指標異常,且對促進胰島β 細胞分泌具有顯著作用。 增強胰島素抵抗作用、促進胰島β 細胞分泌是治療GDM 重要方向[4]。 miR-335-5P 抑制劑靜脈給藥可增強GDM 胰島抵抗作用,可防止胰島β 細胞過度分泌[5]。 miR 作為小型非編碼 RNA,涉及轉錄抑制、靶向降解和基因沉默等生物過程[6]。 miR-335-5P 早被證實與人體胰島素分泌指數呈顯著負相關關系[7];且有文獻顯示在GDM 小鼠體內miR-335-5P 呈高表達,轉化因子-β(transforming factor-β,TGF-β)也呈高表達,考慮兩者具有協同促進作用[8]。 綜合可得,miR-335-5P、TGF-β 可能與 GDM發生和發展有關,但目前對TGF-β 增強機制及對GDM 的影響尚存在爭議。 因此本研究就此展開報道,以期探討 miR-335-5P、TGF-β 與 GDM 胰島素抵抗和胰島β 細胞分泌的關系,現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級 Balb/c 小鼠 105 只,雌性小鼠 70 只,雄性小鼠 35 只;體重 20～25 g,平均(23.56±2.54)kg,6～8 周,購于河北省中西醫結合醫藥研究院[SYXK(冀)2020-006]。 動物使用和處理符合中華人民共和國國家衛生研究院實驗動物保護法和使用指導要求,且通過河北省石家莊市醫學動物倫理委員會批準(IACUC20180105),于河北醫科大學(實驗動物公共服務平臺)[SYXK(冀)2020-002]完成實驗,提供實驗環境:室溫 18℃ ～22℃、濕度 45% ～50%、12 h 明/12 h 暗、動物自由攝食攝水。 以雌性和雄性小鼠以 2 ∶1于 18℃ ～25℃溫度、40%～70%濕度系統中合籠飼養;每天早晨7 點對雌性小鼠進行陰栓檢查,發現陰栓即行陰超檢查,于光鏡下觀察精子,精子和陰栓同時可見記為妊娠第1 天;持續觀察7 d,7 d 內妊娠雌性小鼠(n=60)列為研究對象。實驗過程中掌握熟練輕柔的操作技巧、經常觀察小鼠狀態、對廢棄小鼠實施安樂死等,嚴格遵守動物實驗過程中的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(湖南匯百侍生物科技有限公司,國藥準字 H20020475);無義序列NC(北京百奧萊博科技有限公司);miR-335-5P 模擬物、miR-335-5P抑制劑、si-TGF-β 均購自上?？泼羯锟萍加邢薰?酶聯免疫試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);注射用異戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業有限公司, 國藥準字 H31021725); 磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution, PBS)購于南京科佰生物科技有限公司;飽和碳酸鋰(上海恒遠生物科技有限公司);4%多聚甲醛(上海立瑤生物有限公司);二甲苯(北京百奧萊博科技有限公司);75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇購于上海恒遠生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(Hematoxylin eosin,HE)染色液試劑盒購于邁瑞生物科技有限公司;中性樹膠(南京科佰生物科技有限公司);鼠抗人TGF-β 多克隆抗體(上海田源生物技術有限公司);DAB顯色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);羊抗鼠IgG(上海立瑤生物有限公司);檸檬酸鈉緩沖液(長沙達爾鋒生物科技有限公司);總RNA 提取試劑盒(上海碩嘉生物科技有限公司);異丙醇(蘇州駿宇化工有限公司);反轉錄試劑盒(山東佰仟化工有限公司);miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 引物均購自上?？禎櫳锟萍加邢薰?瓊脂糖(四川科倫藥業有限公司);PCR 反應液(北京索萊寶科技有限公司);RT-PCR 擴增試劑盒購于Sigma;TRIzol 裂解液購于邁瑞生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模及干預方法

①將60 只妊娠小鼠分開喂養,隨機分為空白組(n=10)和 GDM 組(n=50),禁食 12 h 后 GDM 組腹腔注射50 mg/kg 鏈脲佐菌素(必要時用0.1 mol/L檸檬酸溶液稀釋,15 min 內完成),空白組注射等量檸檬酸溶液;4 h 后投喂普通飼料,自由飲水;于妊娠18 d 采用口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)測量空腹血糖(fasting blood sugar, FBG)、空腹胰島素(FIRI)和胰島素抵抗指數(IRI)。 GDM 組共得GDM 模型小鼠48 只,構建GDM 小鼠成功標準:妊娠第18 天妊娠小鼠 FBG<5.1 mmol/L,且 FIRI、IRI 均升高;②將48 只成功構建GDM 模型的小鼠隨機分成A、B、C、D、E、F 組,每組各 8 只小鼠,A 組(模型組)、B 組(模型組+無義序列 NC 溶媒)、C 組(模型組+miR-335-5P 模擬物)、D 組(模型組+miR-335-5P 抑制劑)、E 組(模型組+si-TGF-β)、F 組(模型組+miR-335-5P 抑制劑+si-TGF-β),均經尾靜脈注射,注射后可正常飲食和飲水。

1.3.2 OGTT 實驗

妊娠第17 天晚上禁食禁水8 ～10 h,次日晨抽取空腹尾靜脈血后灌喂2.0 g/kg 葡萄糖水溶液,并于服糖后0.5 h、1 h、2 h 同法抽取尾靜脈血,1000 r/min 離心20 min 進行血清分離并存于-80℃冰箱中;采用血糖儀和血糖試紙條測量血糖濃度,圖譜記錄口服葡萄糖耐量;放射免疫法測定FINS,儀器為I2000sk 化學發光免疫分析儀(美國雅培生物有限公司);根據公式 IRI=-Ln(1/FINS×FPG)計算IRI,IRI 越大,表明機體對胰島素敏感度越低,胰島素抵抗力越強。

1.3.3 高葡萄糖鉗夾技術

妊娠第19 天從GDM 組中各選擇4 只小鼠共24 只、空白組中選擇5 只小鼠進行高血糖鉗夾技術:禁食4 h,經腹腔麻醉注射劑量為50 mg/kg 戊巴比妥鈉,固定和頸靜脈插管;待小鼠狀態穩定后通過尾尖收集血樣50 μL 用于測定FBG 和FINS;通過頸靜脈插管注射初始劑量葡萄糖100 mg/kg 后,連續注射20%葡萄糖溶液,每5 min 監測血糖;調節葡萄糖輸注速率(glucose infusion rate, GIR)使血糖維持于(14.0±0.5)mmol/L;在血糖穩定后5 個時間點獲得平均GIR 作為穩態GIR;收集初始劑量葡萄糖負荷后1～15 min 內處于穩定狀態的血液樣品,確定第一時相胰島素和最大胰島素分泌;根據GIR 值觀察β 細胞功能。

1.3.4 HE 染色

妊娠第19 天選擇未經高血糖鉗夾技術小鼠(GDM 組中各4 只小鼠共24 只、空白組中5 只小鼠)進行空氣栓塞法處死,取小鼠胰島組織用10%甲醛溶液固定,修剪,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋成塊,切成5 μm 連續切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木素染色,流水沖洗,1%鹽酸溶液分化數秒,流水沖洗,伊紅染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察HE 染色結果。

1.3.5 免疫組織化學法

取得“1.3.4”中樣品于10%甲醛溶液中進行固定,脫水,用石蠟包埋,切成4 μm 連續切片,依次脫蠟、修復、梯度乙醇水化、PBS 漂洗、內源性過氧化物酶活性消除;滴加小鼠抗人TGF-β 多克隆抗體(濃度1 ∶100)4℃孵育過夜,PBS 漂洗;滴加即用型生物素化二抗37℃孵育30 min,PBS 漂洗;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育20 min,PBS 漂洗,經DAB 顯色、蘇木素復染、脫水,透明,封片,用于觀察TGF-β 表達。 判定標準:由兩名具有執業資格的病理科醫生采用雙盲法對結果進行判斷和分析,染色強度:0 分為不著色,1 分為淡黃色,2 分為深黃色,3 分為棕黃色;陽性細胞百分率:0 分為陽性細胞百分率0%～5%,1 分為陽性細胞率5%～25%,2 分為陽性細胞率26%～50%,3 分為陽性細胞率51%～75%,4 分為陽性細胞百分率>75%;兩項之和進行綜合判定:≤3 分為陰性,>3 分為陽性。

1.3.6 RT-PCR 法

采用總RNA 提取試劑盒提取血液總RNA,總RNA 逆轉錄成cDNA,以此cDNA 為模板參照引物和探針序列進行擴增,反應條件為:95℃預變性120 s,95℃變性30 s,72℃退火延伸15 s,35 次循環。 根據擴增曲線讀取循環數(Ct),基因的相對表達量=2-△△Ct,以 β-actin 和 GAPDH 為內參照,計算 GDM小鼠血清中 miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析,多組間計量資料比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Snk-q檢驗;采用非參數檢驗Mann-Whitney 法檢驗分級資料;P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組OGTT 實驗指標比較

空白組給藥前后 FBG、FIRI、IRI 均低于 GDM 組(P<0.05);給藥前,GDM 各組 FBG、FIRI、IRI 比較P>0.05;給藥后,A、B 組 FBG、FIRI、IRI 與給藥前比較 P>0.05,D、F 組 FBG、FIRI、IRI 低于給藥前低于C、E 組(P<0.05);見表1。

2.2 各組胰島β 細胞功能比較

空白組給藥前后GIR、第一時相胰島素、最大胰島素均高于 GDM 組(P<0.05);給藥前,GDM 組GIR、第一時相胰島素、最大胰島素比較P>0.05;給藥后,A、B 組GIR、第一時相胰島素、最大胰島素與給藥前比較P>0.05,D、F 組GIR、第一時相胰島素、最大胰島素高于給藥前高于C、E 組(P<0.05),C、E組GIR、第一時相胰島素、最大胰島素低于給藥前(P<0.05);見表2。

2.3 各組胰島 β 細胞中 miR-335-5P、TGF-β 通路關鍵因子表達水平

空白組胰島 β 細胞中 miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 表達低于 GDM 組(P<0.05);C、E 組 miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 表達升高,D、F 組 miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 表達下降;且 D、F 組 miR-335-5P、TGF-β、c-Myc 表達低于 C、E 組低于 A、B 組(P<0.05);見圖1。

2.4 miR-335-5P 與 TGF-β、c-Myc 關系

TGF-β 在胰島β 細胞胞質內表達、為棕黃色,c-Myc 在胰島β 細胞胞質或細胞膜內表達、可顯示為黑色顆粒,在胰島β 細胞中檢測到miR-335-5P 表達時,TGF-β、c-Myc 均有不同程度表達,見圖2。 D、F組 TGF-β 表達高于 C、E 組高于 A、B 組(P<0.05),見圖3、圖4。

表1 各組OGTT 實驗指標比較( ±s)Table 1 Comparison of OGTT experimental indexes among groups

表1 各組OGTT 實驗指標比較( ±s)Table 1 Comparison of OGTT experimental indexes among groups

注:給藥后,與 A 組比較,①P<0.05;與 B 組比較,②P<0.05;與 C 組比較,③P<0.05;與 D 組比較,④P<0.05;與 E 組比較,⑤P<0.05。Note.After administration, Compared with group A, ①P<0.05.Compared with group B, ②P<0.05.Compared with group C, ③P<0.05.Compared with group D, ④P<0.05.Compared with group E, ⑤P<0.05.

組別Groups例數n空腹血糖(mmol/L)FBG空腹胰島素(mIU/L)FIRI胰島素抵抗指數IRI給藥前Before給藥后After給藥前Before給藥后After給藥前Before給藥后After空白組Blank group 10 2.63±0.41 2.58±0.36 19.11±6.63 18.44±5.21 2.43±0.65 2.41±0.74 A 組Group A 8 5.43±1.54 5.51±1.69 26.68±8.46 27.32±7.54 6.21±2.30 6.30±2.18 B 組Group B 8 5.55±1.62 5.49±1.73 25.71±9.97 26.01±8.66 6.18±2.26 6.28±2.24 C 組Group C 8 5.34±1.60 8.21±2.65①②④ 24.88±9.63 40.52±12.67①②④ 6.24±2.34 4.15±1.41①②④D 組Group D 8 5.60±1.46 3.11±0.42①②③⑤ 25.93±9.89 20.20±4.33①②③⑤ 6.30±2.18 3.05±0.06①②③⑤E 組Group E 8 5.62±1.55 8.33±2.53①②④ 26.35±8.57 41.36±13.68①②④ 6.23±2.41 4.22±1.23①②④F 組Group F 8 5.51±1.44 5.36±1.01①②③④⑤ 26.42±8.84 25.16±7.60①②③④⑤ 6.34±2.27 3.66±0.68①②③④⑤

表2 各組胰島β 細胞功能比較( ±s)Table 2 Comparison of islet β cell function in each group

表2 各組胰島β 細胞功能比較( ±s)Table 2 Comparison of islet β cell function in each group

注:給藥后,與 A 組比較,①P<0.05;與 B 組比較,②P<0.05;與 C 組比較,③P<0.05;與 D 組比較,④P<0.05;與 E 組比較,⑤P<0.05。Note.After administration, Compared with group A, ①P<0.05.Compared with group B, ②P<0.05.Compared with group C, ③P<0.05.Compared with group D, ④P<0.05.Compared with group E, ⑤P<0.05.

組別Groups例數n葡萄糖輸注速率mg/(kg·min)GIR第一時相胰島素(ng/mL)First-phase insulin最大胰島素(ng/mL)Maximum insulin給藥前Before給藥后After給藥前Before給藥后After給藥前Before給藥后After 5 30.54±12.36 30.10±15.45 18.26±5.64 18.51±5.14 202.43±50.65 203.61±49.87空白組Blank group A 組Group A 4 20.11±13.02 19.89±12.04 11.13±3.21 10.65±3.36 126.32±32.30 128.32±32.61 B 組Group B 4 20.43±12.65 20.14±11.58 10.79±3.55 11.06±3.43 128.63±30.54 126.74±30.87 C 組Group C 4 19.86±12.87 13.02±8.54①②④ 11.26±3.31 6.24±2.16①②④ 126.51±29.87 100.30±12.35①②④D 組Group D 4 20.33±13.13 28.63±14.21①②③⑤ 11.22±3.54 17.68±4.21①②③⑤ 126.74±30.51 193.54±35.30①②③⑤E 組Group E 4 20.14±12.25 13.32±8.36①②④ 10.87±3.20 6.13±2.30①②④ 127.69±32.13 104.15±11.36①②④F 組Group F 419.87±12.3621.49±10.72①②③④⑤ 11.16±3.18 15.09±3.54①②③④⑤ 1 2 6.59±33.06178.62±15.78①②③④⑤

圖1 各組胰島β 細胞中miR-335-5P、TGF-β 通路關鍵因子表達水平Figure 1 Expression level of miR-335-5P and TGF - β key factors in islet β cells of each group

3 討論

目前,關于GDM 發病機制主要歸納為:孕婦妊娠期間分泌孕激素、糖皮質激素、胎盤生乳素等具有胰島素抵抗作用的激素;且隨著孕周增加含量隨之升高,造成體內肝、肌肉等組織對胰島素敏感性下降,若無法補償胰島素抵抗的增加,可引起體內高胰島素和高血糖,進而發展為GDM[9]。 GDM 可導致孕婦血糖、脂肪、蛋白質代謝功能紊亂,發生巨大兒、羊水過多、自然流產、胎兒畸形、死胎、死產、新生兒低血糖、高膽紅素血癥、孕婦酮癥酸中毒等,對母嬰危害較大[10]。 基于GDM 發病機制,最新研究認為胰島素抵抗和胰島β 細胞分泌與該病發生和發展關系密切。

圖2 miR-335-5P 與 TGF-β、c-Myc 關系Figure 2 Relationship between miR-335-5P,TGF-β and c-Mycall

圖3 TGF-β 陽性表達圖Figure 3 TGF - β positive expression

注:A、B、C、D、E、F 分別表示為 A 組、B 組、C 組、D 組、E 組、F 組。圖4 免疫組織化學染色圖Note.A, B, C, D, E and F were expressed as group A, B, C, D, E and F, respectively.Figure 4 Immunohistochemical staining

早有研究證實,TGF-β 信號可調控細胞增殖、分化、凋亡及胚胎發育等,而TGF-β 信號通路的精準調控對疾病治療具有積極意義[11]。 有研究指出在胰島細胞損傷應答過程中,miR-335-5P 與TGF-β 信號通路間存在一定交叉對話,提示miR-335-5P 可能對調控 TGF-β 有一定價值[12]。 張琳[13]的研究指出,miR-335-5P 通過與胰島表皮因子競爭結合位點抑制胰島α 細胞糖化,由此激活各種細胞因子引起的TGF-β 信號通路,從而阻斷其分泌胰高血糖素。miR-335-5P 現已廣泛應用于各種疾病治療,且在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤疾病中均有應用。 本研究結果顯示,miR-335-5P 上調,可提高 FBG、FIRI、IRI 水平,進一步減少胰島素分泌,這與趙茜等[14]的研究結果較為一致。 探討miR-335-5P 作用機制,考慮其臨床有效性與激活TGF-β 信號轉導通路,提高 c-Myc 表達有關。 c-Myc 是近年來發現的一個新的TGF-β 信號調控因子;且在多篇研究中已指出 c-Myc 可提高TGF-β 穩定性,促進其信號傳遞和靶基因轉錄[15-16];石永英等[17]文獻指出c-Myc 可提高TGF-β 對癌細胞增殖、分化抑制作用。 綜合文獻可得,探討c-Myc、TGF-β 表達水平可提高對機體分化和死亡情況預測價值。 另Tagoma 等[18]在研究中已表明,miR-335-5P 對減少胰島素信號傳導及脂質代謝相關基因有重要價值;Wang 等[19]發現miR-335-5P 表達較高組,胰島素表達下降;Osorio-Yanez等[20]將miR-335-5P 作用于人胰島細胞,發現其能特異性阻斷炎性因子介導的信號轉導通路,而激活TGF-β 通路信號。 這些發現與本研究結果一致,提示 miR-335-5P 可提高 TGF-β 表達。 為進一步證實miR-335-5P 與TGF-β 之間的關系,本文對其相對表達量進行探討分析,得在胰島β 細胞中miR-335-5P表達時,TGF-β、c-Myc 均有不同程度表達,且 miR-335-5P 上調時 TGF-β、c-Myc 表達也升高。 而當TGF-β、c-Myc 和 miR-335-5P 均呈高表達時,發現胰島β 細胞中液泡和無序細胞減少,提示TGF-β、miR-335-5P 對GDM 小鼠葡萄糖耐量和胰島素抵抗改善具有促進作用。

綜上,miR-335-5P 通過激活TGF-β 信號通路對GDM 胰島素抵抗和胰島β 細胞分泌產生積極作用,可為GDM 治療提供臨床依據。 但由于本實驗受時間限制,且實驗主要涉及動物有待探索更多研究對象作進一步研究。