利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構建HMGA2 敲除肝癌細胞株及其功能鑒定

徐 濤顧 鵬陳傍柱葉 行梁春錦張映輝顧為望

(1.南方醫(yī)科大學實驗動物管理中心暨比較醫(yī)學研究所,廣州 510515; 2.東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司,廣東東莞 523808; 3.五邑大學生物科技與大健康學院,廣東江門 529020)

高遷移率蛋白A2(high-mobility group AT-hook 2,HMGA2)屬于高遷移率蛋白超家族成員,是一種非組蛋白染色質結合蛋白,主要包括三個AT-hook區(qū)以及一個酸性C 末端[1]。 AT-hook 區(qū)可以高親和力的結合到基因組中AT 富集區(qū)域,這些區(qū)域一般都是相關基因表達調控元件,從而調控靶基因的表達。HMGA2 基因位于12 號染色體長臂,由5 個外顯子構成。 HMGA2 一般在胚胎發(fā)育早期以及未分化的細胞中高表達,而在成體正常細胞或高度分化的細胞中基本不表達或表達量很低[2]。 但是,研究發(fā)現(xiàn)在肺癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]、結直腸癌[6]等腫瘤組織中HMGA2 的表達均顯著升高,提示HMGA2可能是一個致癌基因,可以作為癌癥早期診斷的潛在分子靶標[7]。 HMGA2 的異常表達通常與腫瘤發(fā)生相關,它主要影響腫瘤細胞的增殖、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、轉移以及腫瘤組織內的微血管生成等過程[8-9]。

肝癌作為一種常見腫瘤,其發(fā)病率與致死率均在各種腫瘤中名列前茅,而且肝癌細胞轉移性強[10]、對常規(guī)化療藥物耐受性較強[11]、預后較差等特點進一步加劇了治療難度。 因此,篩選肝癌治療的潛在分子靶點,對于肝癌的早期診斷、臨床治療以及預后評估具有重大意義[12]。 雖然 HMGA2 已證明在多種腫瘤中均可作為分子靶標以及預后評估的潛在分子,但HMGA2 在肝癌中的作用目前研究較少。 本研究采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引起肝癌細胞系HepG2 中的HMGA2 基因大片段刪除,進而失活該基因,建立HMGA2 敲除細胞株,并對此進行了相關功能的鑒定,探討HMGA2 對于肝癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響,從而為肝癌的靶向治療提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

人肝癌細胞系HepG2 購自美國ATCC。

1.2 主要試劑

PX458 質 粒 購 自 Addgene; 高 糖 DMEM(8115247)、胎牛血清(42A0378 K)、雙抗(21442)、0.25%胰蛋白酶(25200)購自Gibco;Lipofectamine?2000(2004957)、 Opti-MEM ? (1119701)、 TRIzol(15596026 ) 購自 Thermo; 反轉錄試劑盒(AI40826A)、熒光定量 PCR 試劑盒(AJ51622A)、細胞基因組提取試劑盒(AK2101)、Premix TaqTM酶(A191625A)、T4 連接酶(AH70103A)購自 TaKaRa;DH5α 感受態(tài)細胞(180428)與質粒小提試劑盒(S7923)購自TIANGEN;Bbs Ⅰ內切酶(00397116)、T4 PNK 磷酸化酶(10020296)購自NEB;Transwell小 室 (11919023)、 Matrigel 膠 (9119018) 購 自Corning;全蛋白提取試劑盒(20190213)購自凱基生物;HMGA2 一抗(79h6360) 及 Western blot 二抗( 12v9698 ) 購 自 Affinity、 GAPDH 一 抗( AH08191878 ) 購 自 Bioss; CCK8 試 劑 盒(EG20180126)購自南京恩晶生物。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

HepG2 細胞培養(yǎng)在含有10% FBS、1%青/鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中,于37℃、5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng),每隔3 d 換一次液。 取生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 sgRNA 寡核苷酸鏈設計

根據(jù)GenBank 中發(fā)表的HMGA2 序列信息(ID:NM_003483),利用CRISPR/Cas9 sgRNA 在線設計軟件(http:/ /crispor.tefor.net/)分別在HMGA2 基因的第一外顯子與第二外顯子處各設計一條sgRNA,分別命名為sgE1 與sgE2(如圖1),并在正義鏈的5′端添加CACC 接頭,在反義鏈的5′端添加AAAC 接頭,便于與酶切載體連接;此外,由于sgE2 不是以G開頭,所以需在接頭與sgE2 的5′端之間加上G,以提高U6 啟動子的轉錄活性。 最終oligo 序列如表1所示。

1.3.3 重組載體PX458-sgRNA 構建

兩條sgRNA 進行末端磷酸化與退火反應,反應體系為:sgRNA-T 1 μL,sgRNA-B 1 μL,T4 PNK 0.5 μL,T4 Ligase Buffer 1 μL,ddH2O 6.5 μL,37℃反應30 min 后于沸水中加熱5 min,自然冷卻至室溫。 用T4 連接酶將退火產物與經Bbs I 酶切的PX458 質粒連接,16℃連接30 min,并將連接產物轉化入大腸桿菌DH5ɑ 中,均勻涂布于含氨芐青霉素的LB 固體平板上37℃過夜培養(yǎng),挑取單克隆鑒定并由睿博興科廣州分公司采用Sanger 測序法進一步鑒定正確插入。

1.3.4 細胞轉染與單克隆篩選

將狀態(tài)良好的細胞鋪到24 孔板中,待細胞匯合度達到80%時采用Lipo2000 將兩個sgRNA 重組質粒混合轉染HepG2 細胞,轉染2 d 后于熒光顯微鏡下觀測轉染效率。 將細胞懸液稀釋至每毫升100 個細胞,以每孔10 μL 加入96 孔板,進行單克隆篩選,待克隆長至合適大小后挑取克隆于24 孔板中,并進行敲除鑒定。

1.3.5 細胞敲除株鑒定

采用NP40 裂解細胞,程序為:56℃ 1 h,95℃ 10 min。 擴增HMGA2 基因敲除后的短序列片段,PCR引 物 序 列 為:HMGA2-F: 5′-GACGTCCGGTGTTG ATGGTG-3′,HMGA2-R: 5′-CAAATTCCTGGCTGCG GAGT-3′,擴增程序為:95℃ 3 min;94℃ 30 s,60℃30 s,72℃ 30 s,36 個循環(huán);72℃ 2 min。 PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并送睿博興科廣州分公司進行Sanger 測序。 對經測序鑒定為可能Indel 的片段采用 pMD19-T Vector Cloning Kit 進行 TA 克隆,隨機挑取10 個單克隆進行Sanger 測序,并通過BLAST 在線軟件比對,鑒定敲除株基因型。

1.3.6 實時熒光定量PCR

采用TRIzol 法提取RNA,并利用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA,采用嵌合熒光法對HMGA2的表達情況進行定量分析,以GAPDH為內參。qPCR 反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán);60℃ 2 min。 采用 2-ΔΔCt法分析基因相對表達情況。 所用引物如表2 所示。

1.3.7 蛋白表達水平檢測

將對照組與敲除株細胞鋪于六孔板,待細胞長至80%匯合度時,用冷的PBS 洗兩遍,加入200 μL細胞裂解液于冰上裂解30 min。 4℃,12000 r/min離心5 min。 吸取上清,用BCA 法進行蛋白定量,并用5×Loading buffer 調整蛋白至適當濃度,100℃水浴 5 min。 SDS-PAGE 電泳,恒壓 80 V 30 min,120 V 60 min,切下目的條帶與內參條帶,轉PVDF 膜。 用5% BSA 室溫封閉1 h,一抗4℃過夜孵育,TBST 洗膜5 min×4 次,二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜5 min×4 次。 采用ECL 化學發(fā)光法顯影。

1.3.8 CCK8 細胞增殖實驗

圖1 sgRNA 位點Figure 1 Locus of sgRNA

表1 sgRNA oligo 序列Table 1 Sequence of sgRNA oligo

表2 qPCR 引物Table 2 qPCR amplification primers

用0.25%胰酶消化細胞,制成單細胞懸液。 將細胞密度調整為每毫升1×104個,每孔200 μL。 加入96 孔板中,每個樣品6 個重復,置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 分別在 0 h,24 h,48 h,72 h 和96 h 每孔加入10 μL CCK8,37℃避光孵育4 h,用酶標儀測定450 nm 處吸光度。 用樣品吸光度減去空白吸光度得到相對吸光度值,采用Graphpad prism 5軟件繪制生長曲線。

1.3.9 克隆形成實驗

用0.25%胰酶消化細胞,制成單細胞懸液,以1000 個/孔將細胞均勻鋪到六孔板中,每3 d 換一次液。 待長出肉眼可見單克隆后,采用4%多聚甲醛固定細胞,1%結晶紫溶液染色,計數(shù)細胞數(shù)大于50的單克隆數(shù)量。

1.3.10 腫瘤遷移與侵襲實驗

用胰酶消化細胞后,將細胞移入離心管中,1000 r/min 離心5 min,PBS 洗兩遍并用無血清培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞密度調整為每毫升5×105個。 對于遷移實驗,每個Transwell 上室加入100 μL 細胞懸液,下室加入 600 μL 含 10% FBS 的全培,培養(yǎng)箱中孵育24 h;對于侵襲實驗,先以1 ∶8的比例于冰上采用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel 膠,每個Transwell 上室加70 μL 稀釋的 Matrigel 膠,培養(yǎng)箱中孵育6 h,待膠完全凝固后,下室加入600 μL 含10% FBS 的全培,培養(yǎng)箱中孵育30 min,向上室中輕柔加入200 μL 細胞懸液,培養(yǎng)箱中孵育24 h。 取出上室,PBS洗3 遍后用棉簽擦去上室孔內的細胞與Matrigel膠,4%多聚甲醛固定15 min,結晶紫溶液染色10 min,在10×10 倍鏡下隨機選取十個視野,計數(shù)細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 24.0 進行數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計學分析,結果以平均數(shù)±標準差(±s)表示。 組間比較采用t檢驗,P< 0.05 認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PX458-sgRNA 載體鑒定

將兩對sgRNA oligo 退火形成雙鏈后連接到經Bbs I 酶切的PX458 質粒上,轉化入大腸桿菌并挑取單克隆菌落,經PCR 鑒定后將陽性質粒測序。 測序結果顯示兩對sgRNA 均正確插入到酶切位點內(圖2)。

2.2 細胞敲除株鑒定

將兩對PX458-sgRNA 載體混合轉染HepG2 細胞,采用有限稀釋法獲得單克隆細胞集落,用一對鑒定引物,采用短片段擴增程序進行PCR 鑒定,敲除株由于大片段刪除可以得到400 bp 左右的片段(圖3A)。 將擴增片段測序,結果顯示在 sgRNA 位點處存在套峰,即插入/缺失突變(圖3B)。 進一步基因型分析顯示,敲除株的基因組存在大片段缺失(表3)。 對敲除株細胞進行RT-qPCR 檢測,結果表明在mRNA 水平上HMGA2 的表達已有大幅度下降(P< 0.01,圖3C)。 Western blot 檢測顯示已經完全沒有HMGA2 蛋白的表達(圖3D)。 綜合結果可知,獲得的細胞株為HMGA2-/-細胞株。

2.3 HMGA2 敲除引起細胞增殖速率的改變

采用CCK8 細胞增殖實驗以及克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力以及克隆形成能力。 CCK8 實驗表明,HMGA2 敲除后細胞的增殖速率明顯減慢(圖4A);而克隆形成實驗也表明HMGA2 敲除引起克隆形成能力減弱,細胞存活率降低(121.83 ± 21.68 vs 59.50 ± 20.68,P< 0.01,圖4B)

2.4 HMGA2 敲除對于腫瘤細胞遷移與侵襲的影響

Transwell 遷移實驗表明, 相對于野生型,HMGA2 敲除后 HepG2 的遷移能力明顯減弱(359.67 ± 32.53 vs 245.61 ± 24.23,P< 0.05)(圖5)。 Transwell 侵襲實驗也表明HMGA2 的敲除也會導致 HepG2 細胞體外侵襲能力減弱(251.33 ±43.43 vs 47.00 ± 10.00,P< 0.01)(圖5)。

圖2 PX458-sgRNA 載體測序結果Figure 2 Sequencing results of PX458-sgRNA vectors

注:A:PCR 鑒定大片段刪除(M:DL1000 marker);B:Sanger 測序顯示在sgRNA 位點處存在插入/缺失突變;C:RT-qPCR 檢測mRNA 表達水平;D:Western blot 檢測HMGA2 蛋白水平表達。 與對照組比較,??P < 0.01。圖3 細胞敲除株鑒定結果Note.A, Larger fragment deletion was tested by RCR (M, DL 1000 marker).B, Indel in sgRNA locus was investigated by Sanger sequencing.C, Expression levels were measured by RT-qPCR.D, Western blot to analyze HMGA2 protein upon knockout HMGA2.Compared with control group, ??P < 0.01.Figure 3 Identification of knockout cell line

表3 細胞株基因型Table 3 Genetypes of cell line

注:A:CCK8 實驗檢測細胞增殖速率;B:克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力。 與對照組比較,??P< 0.01。圖4 HMGA2 敲除對于細胞增殖的影響Note.A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial.B, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay.Compared with control, ??P < 0.01.Figure 4 Effect of proliferation in HMGA2 knockout

注:與對照組比較,?P < 0.05,??P < 0.01。圖5 HMGA2 敲除對于細胞遷移與侵襲的影響Note.Compared with control, ?P<0.05, ??P < 0.01.Figure 5 Effect of HMGA2 knockout on migration and invasion

3 討論

人類HMGA2 基因位于染色體12q15 區(qū)域,其編碼的蛋白屬于高遷移率蛋白家族成員,主要作為一種轉錄調控因子,通過蛋白-蛋白或者蛋白-DNA 互作調控靶基因的表達。 有研究表明,HMGA2 主要在胚胎早期以及腫瘤細胞中高表達,而在正常成體組織中則表達量很低或不表達,提示HMGA2 對于胚胎早期的正常發(fā)育極為重要,同時也是一個重要的致瘤因子。 Yang 等[13]發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2 抑制急性髓性白血病細胞的遷移、侵襲以及生存能力,增強其凋亡速率以及對藥物的敏感性。 同樣的,Zhu等[14]沉默鱗狀細胞癌中的HMGA2 也引起細胞中EMT 有關基因的下調,而過表達則可使癌細胞獲得干細胞樣特征。 對胃癌的病例研究發(fā)現(xiàn),HMGA2有助于胃癌的血管生成,從而促進癌細胞的生長,此外還與腫瘤患者的預后不良有關[15]。 但是對自發(fā)性胰腺癌小鼠的研究發(fā)現(xiàn),HMGA2 敲除鼠與野生型鼠在胰腺癌的發(fā)生率、對藥物的敏感性以及預后等指標上并沒有太大差別,表明HMGA2 作為胰腺癌的分子標記以及預后標志物還有待商榷[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系HepG2 中敲除HMGA2 后細胞的遷移與侵襲能力顯著降低,表明HMGA2 也與肝癌細胞的遷移與侵襲有關。 此外,通過對原發(fā)性肝癌的病例研究也發(fā)現(xiàn)HMGA2 陽性患者明顯預后不良[17],提示HMGA2 也可能作為評估肝癌預后的分子標記。

HMGA2 除了與細胞的遷移、侵襲以及腫瘤預后有關外,還與腫瘤細胞的增殖與抗凋亡有關。 研究表明,在急性髓性白血病細胞中,HMGA2 主要通過PI3K/Akt/mTOR 通路促進癌細胞的生長增殖,HMGA2 的敲除會引起細胞 G2/M 期阻滯[18]。 在膀胱癌中,HMGA2 抑制了 TGF-β/Smad 通路以及Wnt/β-catenin 通 路, 同 時 沉 默HMGA2 降 低 了MMP2 以及MMP9 的表達水平,提高了癌細胞的凋亡速率[9]。 與此類似,李鵬等[19]發(fā)現(xiàn)敲減HMGA2抑制了TGF-β1 誘導的人胚腎成纖維細胞的膠原合成,促進了ROS 的產生。 ROS 的產生則會引發(fā)細胞的凋亡反應,有助于阻止癌細胞的生長。 Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn) HMGA2 的三個 AT-hook 區(qū)可以與P53 結合,從而提高P53 泛素化水平,加快P53 蛋白的降解。 本研究通過CCK8 實驗以及克隆形成實驗表明,HMGA2 敲除也同樣引起了HepG2 細胞的增殖速率以及克隆形成能力的顯著降低,但具體的分子機制還有待進一步闡明。

綜上所述,HMGA2 在多種腫瘤中均發(fā)揮了促進腫瘤細胞增殖,增強遷移與侵襲能力以及降低細胞凋亡速率等作用。 與此類似,本研究發(fā)現(xiàn)HMGA2在肝癌細胞 HepG2 中也發(fā)揮相似的功能,敲除HMGA2 顯著抑制了HepG2 細胞的增殖速率、克隆形成能力、遷移與侵襲能力,表明HMGA2 也可能作為一個肝癌治療的潛在分子靶標。