基于雌激素受體介導的神經營養因子通路探討左歸丸對腦缺血再灌注損傷的保護作用

劉 宏 易婭靜 于 穎 代巧妹 張雨薇 楊 婧 張 博 仲麗麗

1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學博士后流動站，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學研究生學院，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040；5.黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院，黑龍江哈爾濱 150040

卒中后神經損傷是致殘的主要原因[1]。腦卒中是一種具有兩性差異的疾病，女性患腦卒中的風險比男性低。然而，這種保護作用在絕經后由于內源性雌激素的丟失而減弱。雌激素替代療法在實驗研究和臨床試驗中存在爭議[2-4]。古方左歸丸出自《景岳全書》，具有填精髓、補腎陰之效[5]。在臨床被用于治療肝腎陰虛型腦梗死恢復期、腦供血不足型眩暈、腦卒中后遺癥患者呈反復頭暈、頭痛伴手足麻木、腰酸耳鳴、記憶力減退等屬腎精虧損、髓海空虛諸癥[6-7]。中醫學認為，“腎主生殖”[8]，腎的部分功能相當于現代醫學“下丘腦-垂體-性腺軸”[9]的功能。有實驗顯示[10]左歸丸可明顯提高去卵巢大鼠海馬ERβ 表達，改善其驚恐反應，并可通過上調海馬組織及齒狀回神經生長因子（NGF）水平來延緩大鼠衰老[11]。本課題組前期實驗證實，左歸丸還可以通過上調腦源性神經營養因子（BDNF）水平改善受驚嚇大腦中動脈阻塞（MCAO）大鼠的缺血再灌注損傷[12]。然而，左歸丸預處理是否通過雌激素受體介導的BDNF 和NGF 信號通路改善腦缺血再灌注損傷仍不清楚。本研究探討左歸丸是否通過調節雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號通路發揮神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性SD 大鼠，SPF 級，8～10 周齡，170～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠置于籠內[溫度（22±1）℃，濕度45%～55%]，12 h 燈/12 h 暗循環，允許隨意獲取食物和水。所有實驗方案均符合黑龍江中醫藥大學醫學倫理委員會批準的《實驗動物飼養與使用規范》。

1.2 主要藥物和試劑

左歸丸（北京同仁堂藥店，批號：070503）；17β-雌二醇（Beyotime，貨號：MB1098）；ICI182780（medchemexpress，貨號：HY-13636）；anti-ERα（Proteintech Group，貨號：21244-1-AP）；anti-ERβ（Sangon Biotech，貨號：14007-1-AP）；anti-BDNF（Sangon Biotech，貨號：D121057）；anti-NGF（Boster，貨號：BA0611-2）；antip-CREB（Bioss，貨號：bs-0036R）；anti-TrkB（Bioss，貨號：bs-0175R）；anti-TrkA（Bioss，貨號：bs-0193R）；βactin（Bioss，貨號：bsm-33139M）。

1.3 分組

采用隨機數字表法將大鼠分為六組（n=18）：假手術組（只切口不插栓線）、I/R 組（Longa 線栓法行MCAO 手術）、OVX+I/R 組（卵巢摘除+MCAO 手術）、OVX+I/R+Zuogui Pills 組（卵巢摘除+MCAO 手術+左歸丸1.62 g/kg，灌胃）、OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780組（卵巢摘除+MCAO 手術+左歸丸灌胃+ICI182780 3 mg/kg，腹腔注射）、OVX+I/R+17β-estradiol 組（卵巢摘除+MCAO 手術+17β-estradiol 100 μg/kg，腹腔注射）。用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，在大鼠腹部正中開小切口，行雙側卵巢摘除術（ovariectomy，OVX），術后，縫合皮膚。假手術組大鼠只切口不摘除雙側卵巢。OVX 后3 d，OVX 雌性大鼠給予無色溶劑（DMSO）、17β-estradiol（100 μg/kg）腹腔注射[13]，1.62 g/kg 左歸丸湯劑灌胃，連續5 d。第7 天線栓法[14-15]行MCAO 手術，1 h-MCAO，再灌注24 h。OVX+MCAO+Zuogui Pills+ICI182780 組給予ER 拮抗劑ICI182780（3 mg/kg，腹腔注射）[16]。假手術組大鼠行無大腦中動脈閉塞的假手術（不栓線）。假手術組、I/R 組及OVX+I/R 組大鼠均給予等量DMSO 注射液。

MCAO 致麻醉大鼠短暫腦缺血[17]。麻醉后行頸中線切口，將18～19 mm 的單絲插入大腦中動脈，以封堵大腦中動脈。閉塞1 h 后，通過移除單絲，大腦血流恢復（再灌注）24 h。再灌注后進行神經學評估和新奇物體識別試驗。然后，將腦組織切除并進行免疫印跡實驗。

1.4 模型篩選：神經功能缺損評估

再灌注后（第8 天），根據Garcia 及其同事描述的方法用神經功能評分評估神經功能缺損[18]。該評估系統由6 個測試組成，包括自發活動、前爪伸展、四肢運動的對稱性、振動觸覺反應、身體本體感覺和攀爬。每個項目的分數范圍0～3 分，最高分是18 分。

1.5 新奇物體識別實驗

再灌注后進行新奇物體識別實驗。這項測試利用了動物天生的傾向，即優先探索新事物。簡單地將大鼠置于含有A、B 兩個相似物體（顏色、大小、形狀）的籠中，在MCAO 前4 d 每天訓練20 min。于MCAO 后2 h，大鼠被允許探索對象A 和B，勘探時間記錄5 min。24 h，對象B 被換做一個新的物體C，讓大鼠在熟悉的物體A 和陌生的物體C 之間進行探索，同樣記錄5 min 物體的探索時間。在這個測試中，探索被定義為物理定位/操作和觀察對象（從鼻子到觀察對象的距離＜2 cm）。

1.6 免疫蛋白印跡

腦組織于含1%PMSF 的RIPA 裂解液中冰裂解5 min。4℃，離心，收集上清液測定蛋白濃度。分離的蛋白帶轉移到微孔PVDF 膜上。主要抗體在4°C 孵育一夜。抗體有anti-ERα（1∶1000），anti-ERβ（1∶500），anti-BDNF（1∶500），anti-NGF（1∶500），anti-p-CREB（1∶500），anti-TrkB（1∶500），anti-TrkA（1∶500）。HRPlabeled 二抗（1∶5000）在37℃孵育45 min。Gel-Pro 分析儀分析。β-actin（1∶500）被用作內參。

1.7 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。計數資料以例數表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的神經功能和認知能力比較

與假手術組比較，I/R 組神經功能評分及探索指數下降（P ＜0.05）。與I/R 組比較，OVX+I/R 組各指標下降 （P ＜0.05）。與OVX+I/R 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標升高（P ＜0.05）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780 各指標下降（P ＜0.05）；OVX+I/R+Zuogui Pills 組與OVX+I/R+17β-estradiol組各指標比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠海馬ERα 和ERβ 水平比較

圖1 各組感覺運動功能和識別記憶能力比較

ERα、ERβ 表達在細胞核，棕黃色為陽性染色。在每張切片海馬區選擇10 個表達強的高倍視野（400×）計陽性細胞數。與假手術組比較，I/R 組海馬區ERα和ERβ 水平升高（P ＜0.01）。與I/R 組比較，OVX+I/R組海馬區ERα 和ERβ 水平下降（P ＜0.01）。與OVX+I/R 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17βestradiol 組海馬區ERα 和ERβ 水平升高（P ＜0.01）；與OVX+I/R +Zuogui Pills 組 比 較，OVX +I/R +Zuogui Pills+ICI182780 海馬區ERα 和ERβ 水平下降 （P ＜0.01）；OVX+I/R+Zuogui Pills 組與OVX+I/R+17β-estradiol 組海馬區ERα 和ERβ 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2～4。

圖2 ERα 在海馬的表達（DAB 染色，400×）

圖3 ERβ 在海馬的表達（DAB 染色，400×）

2.3 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB 和CREB 蛋白及mRNA 水平比較

與假手術組比較，I/R 組BDNF、NGF、TrkA 蛋白表達水平升高 （P ＜0.01）；NGF、TrkA mRNA 表達水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與I/R 組比較，OVX+I/R組大鼠各指標（除CREB 外）水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與OVX+I/R 組 比 較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標 （除CREB外） 水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780組各指標 （除CREB 外） 水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標（除CREB 外）水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖5～6。

3 討論

內源性雌激素缺乏會增加絕經后婦女的卒中風險[19]。對于缺血性腦卒中的預防和治療具有重要意義。本課題組以往研究已經證明左歸丸可以改善缺血性腦損傷大鼠的記憶功能[20-21]。本研究結果同樣顯示，左歸丸能夠減輕OVX 大鼠在MCAO 后感覺運動功能和識別記憶的損傷。這個神經保護作用左歸丸與17β雌二醇相似。

ERα、ERβ，雌激素受體的兩個重要的亞型，調節細胞生長，生存和新陳代謝，調節下游目標的表達[22]。Shin 等[23]研究顯示，ERs 參與了OVX 小鼠MCAO 誘導的缺血性腦損傷。左歸丸是否改善了腦I/R 損傷由調制ERα 和ERβ 仍不清楚。在本研究對左歸丸預處理缺血后腦損傷大鼠進行ERα 和ERβ 檢測，結果發現，MCAO 手術不能讓卵巢摘除的大鼠ERα、ERβ 表達增加，如果補充17β 雌二醇可以上調ERα 和ERβ 水平。結果顯示，腦內ERs 的升高可能是I/R 損傷的互補效應之一。這種互補作用可能由于雌激素缺乏而受到損害引起的。有趣的是，本研究發現左歸丸治療后腦內ERα 和ERβ 重新上調，這種對ER 表達的刺激作用與17β 雌二醇相似。因此，本研究顯示，與外源性雌激素一樣，左歸丸也通過調節ER 信號通路發揮神經保護作用。

圖4 各組大鼠海馬的ERα 和ERβ 及β-actin 蛋白的免疫印跡圖

圖5 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB及β-actin 蛋白的免疫印跡圖

NGF 是第一個被發現的神經營養因子（neurotrophins，NTs），在海馬和皮層中表達。據報道，通過與TrkA 結合促進中樞和外周神經系統神經元的存活和分化[24]。活性的NGF-TrkA 信號進一步觸發ERK 的磷酸化，激活其下游蛋白CREB，導致學習記憶能力的提高[25]。BDNF 是一種神經營養因子，最初從豬腦中提取，廣泛表達于中樞神經系統[26]。BDNF 與其受體TrkB 結合，通過激活下游信號通路發揮促神經元生存作用[27-28]。此外，往期研究顯示[29-30]，左歸丸可以通過調節BDNF和NGF 防治神經退行性疾病、糖尿病性視網膜病變和β-淀粉酶誘導的神經毒性損傷。本研究結果顯示，左歸丸可以激活BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信號通路。

圖6 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB mRNA 水平

已有研究顯示，一種新的植物雌激素可通過ER 依賴的Akt/Nrf2 通路或ER 依賴的內質網應激通路減輕腦I/R 損傷或新生兒腦缺血缺氧損傷[31-32]。因此推測，左歸丸可能通過ER 依賴的BDNF-TrkB 和NGFTrkA 信號通路，保護OVX 大鼠的大腦I/R 損傷。為了研究ERs 在左歸丸神經保護效應中的作用，本研究進一步使用ER 拮抗劑ICI182780 來阻斷左歸丸存在時的ER 信號通路。結果顯示，ICI182780 注射增加神經功能受損和認知能力損害，增加腦梗死面積、誘導神經元損失，降低ERα/β 水平，抑制了左歸丸對BDNF-TrkB 甚至NGF-TrkA 的促進作用。這些數據顯示，ER 介導的BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信號通路是左歸丸神經保護作用的關鍵通路。