克氏原螯蝦黑鰓上一種木賊鐮刀菌的分離鑒定

趙楠 張世奇 唐自力 李浩 趙桂華,3

(1江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400；2句容市水產技術指導站，江蘇句容 212400；3句容市潤泰生物科技有限公司，江蘇句容 212400)

木賊鐮刀菌[Fusariumequiseti(Corda)Sacc.1886]是1種世界性真菌，也是克氏原螯蝦(俗稱小龍蝦)黑鰓上的1種真菌，小龍蝦是該真菌的新宿主。之前尚未有在溫帶至熱帶地區的小龍蝦中發現該真菌的報道。

最近幾年的研究發現，在小龍蝦養殖地區，由鐮刀菌屬(FusariumLink ex Fr 1809)引起的小龍蝦黑鰓病(black gill disease)普遍發生，常常造成小龍蝦死亡。黑鰓病又被稱為鐮刀菌病害(Fusarium disease)[1]。鐮刀菌屬種類繁多，是1類具有經濟重要性的真菌。到2020年12月31日為止，該屬共記載了1 662個種、亞種、變種和專化型，有一些種類是動植物的重要病原菌，有的也存在于土壤中。

在對螯蝦科(Astacidae)和擬螯蝦科(Parastacidae或Austroastracidae)蝦類的研究報道中，茄鐮刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc 1881][2-6]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchltdl.1824)[7]、肉紅色鐮刀菌[F.incarnatum(Roberge)Saccardo 1848][1,6]等均能引起黑鰓病，但尚未見木賊鐮刀菌引起小龍蝦黑鰓病的報道。

為了更好地預防和控制小龍蝦黑鰓病的發生和傳播，首先要準確鑒定病原。本研究在實驗室條件下的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上，對感染小龍蝦黑鰓病的病蝦鰓片進行分離培養和純化，得到了1個鐮刀菌菌株，并通過形態學觀察描述和DNA分子測序對其進行了種類鑒定，以期對小龍蝦養殖和病害防控提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 材料來源

2018年6月13日，在江蘇省句容市潤泰生物科技有限公司養殖基地采集患黑鰓病的小龍蝦樣本，裝入標本袋，放在4 ℃低溫冷藏箱備用。

1.2 組織分離方法

將病蝦的黑鰓用自來水沖洗后，再放在滅菌水中清洗3次，取出，用滅菌紙吸干鰓上的水分，用滅菌的剪刀將病鰓片剪下，在無菌條件下轉移到盛有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基的培養皿內，放在(25±2)℃的PRX-250A型智能人工氣候箱內(RH 70%，黑暗)培養。用此方法共分離20皿120塊黑鰓組織，4 d后取出檢查，統計分離結果。對不同顏色的真菌菌落分別進行純化、編號。本研究中的菌株標號為NLHf-3。對此次分離到的細菌不做進一步研究。

1.3 形態觀察

將NLHf-3菌株接種到PDA平面培養基上，培養7～10 d(培養條件同1.2)，觀察菌落的生長情況。

將NLHf-3菌株接種到滅菌載玻片上的PDA培養基上[8]，培養5～6 d(培養條件同1.2)，待產生分生孢子后，做成臨時玻片，在蔡斯(ZEISS Imager A1)光學顯微鏡下觀察，觀察分生孢子梗和分生孢子的形態，測量其大小(n=30)，并拍照。再根據相關資料[9-11]進行形態學鑒定。

1.4 DNA提取、純化和測序

該真菌的DNA提取、PCR擴增和測序反應的方法和步驟由南京金斯瑞生物科技有限公司協助完成。測序菌株代號為174(保存菌種NLHf-3，即黑鰓病真菌3號菌株)。

測序試驗流程：(1)設計特異性引物。引物名稱為ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG),ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)；(2)提取基因組DNA；(3)合成引物，擴增ITS區全序列，擴增；(4)PCR產物純化，即使用膠回收方法進行PCR產物純化；(5)使用ABI3730XL測序儀對PCR產物進行測序；(6)在GenBank數據庫中，通過NCBI的Blast檢索系統進行序列同源性比對。

2 結果

2.1 分離結果

在120塊黑鰓組織(見圖1)上共得到真菌菌落73個，占60.8%；細菌菌落47個，占39.2%(本文不進行研究)。經初步鑒定，73個真菌菌落隸屬于5屬7種，其中包括木賊鐮刀菌。其他的分離結果在本文中不進行討論，另外單獨發表。

2.2 木賊鐮刀菌

Fusariumequiseti(Corda)Sacc.,Syll.fung.(Abellini)4：707(1886)[9-11]。

MycoBank Number：199819。

異名(Synonymy)：SelenosporiumequisetiCorda,Icon.fung.(Prague)2:7(1838)；Fusariumequisetivar.crassumWollenw.,Fusariaautographicadelineata3:no.921(1930)。

木賊鐮刀菌種以下的分類單位有2個亞種，7個變種和3個專化型。

2.2.1 形態特征

在PDA培養基上[(25±2)℃，RH 70%]，菌落呈淡米黃色、疏松、棉絮狀(見圖2)，平均日生長量約為1.1 cm。分生孢子梗單生(見圖3)、具分枝，其上著生倒棍棒狀的瓶梗，大小為(12.0～17.0)μm×(3.0～4.0)μm；大分生孢子形狀變化大，呈紡錘形或鐮刀形，3～5個分隔，具有明顯的基細胞，或稍彎曲，孢體中間寬、兩端漸收窄(見圖3)，大小為(31.0～47.0)μm×(4.0～5.0)μm；在PDA上小型分生孢子少。在菌絲上有厚垣孢子形成，單生或串生(見圖4)，表面較粗糙，呈球形或近球形，直徑為7～9 μm。在人工培養基上不產生有性世代。

2.2.2 分子鑒定

通過對NLHf-3菌株的菌絲進行DNA提取，用ITS1和ITS4的通用引物進行PCR擴增，得到長度為529 bp的特異性DNA片段。擴增ITS區全序列，結果見圖5。

通過對擴增片段進行測序，用NCBI的Blast檢索系統在Genbank數據庫中搜尋相似序列，結果與庫中登錄號為MH290363.1和KY910876.1(包括小亞基核糖體RNA基因，部分序列；ITS1 5.8S核糖體RNA基因，ITS2完整序列；大亞基核糖體RNA基因，部分序列)的同源性均為99%，因此可以確定小龍蝦黑鰓上的真菌菌株為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。

2.2.3 4種鐮刀菌形態比較

除了木賊鐮刀菌外，在小龍蝦黑鰓上還有茄鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、肉紅色鐮刀菌等其他3種鐮刀菌的報道[1-7]。這幾種鐮刀菌形態特征雖有異同，但是，如果不借助于DNA測序結果，僅從形態上區分它們還存在一定難度。4種鐮刀菌分生孢子梗、分生孢子和厚垣孢子的區別特征見表1。木賊鐮刀菌的菌絲細胞中大多含有2～5個細胞核，但在個別的分生孢子細胞中發現了單核[12]，在分隔處會產生8個色氨酸鏈[13-14]。

圖1 小龍蝦黑鰓Fig.1 Black gills of Procambarus clarkii

圖2 菌株NLHf-3的菌落形態Fig.2 Colony morphologies of stain NLHf-3

a.單根分生孢子梗 single conidiophore; b.大分生孢子 macroconidium。 圖3 菌株NLHf-3的分生孢子梗和分生孢子Fig.3 Conidiophore and conidium of stain NLHf-3

a.單生 singly; b.串生 chains。 圖4 菌株NLHf-3的厚垣孢子Fig.4 Chlamydospore of stain NLHf-3

M.DNA Marker 3 000;1.stain NLHf-3。 圖5 菌株ITS 1和ITS 4區域PCR擴增產物電泳圖Fig.5 Electrophoregram figure of PCR amplification products in ITS 1 and ITS4 regions

3 總結和討論

木賊鐮刀菌作為小龍蝦體上微生物成員的1種，在我國屬于首次報道。

現已發現有多種鐮刀菌(Fusariumspp.)能侵染蝦類，如小龍蝦、歐洲高貴小龍蝦(Astacusastacus)、土耳其小龍蝦(A.leptodactylus)、白爪小龍蝦(Austropotamobiuspallipes)、信號小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)和西墨蘭絲螯蝦(Procambarussimulans)[4,15-17]、近緣螯小龍蝦(Cambarusaffinis)和叉肢螯蝦(Orconecteslimosus)[18]、澳大利亞白色螯蝦(Cheraxdestructoralbidus)和佛羅里達藍螯蝦(C.tenuimanus)[19]、龍蝦[20]、對蝦(Penaeusorientalis)及其他蝦類[3,21-24]。

表1 小龍蝦黑鰓上4種鐮刀菌的形態特征[10]

鐮刀菌導致小龍蝦病害的主要原因是鐮刀菌在生長過程中會產生多種毒素，對動物機體造成病理性損傷，抑制免疫機能，誘導細胞凋亡，如鐮刀菌T-2毒素(T-2 Toxin)會引起白細胞減少癥，使造血系統功能衰退。如果小龍蝦被木賊鐮刀菌感染，木賊鐮刀菌所分泌的毒素會對小龍蝦的細胞產生不良影響，從而引發病害。

木賊鐮刀菌是動植物的病原菌，能分泌格鏈孢酚(Alternariol)、交鏈孢酚單甲醚(Djalonensone)、腺嘌呤核苷和過氧麥角甾醇[25]、醌類化合物[26]，以及伏馬素FB1(Fumonisin B1)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(嘔吐霉素，DON)。按其化學結構和毒性，鐮刀菌毒素可以分為單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內酯和串珠鐮刀菌素。單端孢霉素類通常要溫度超過200 ℃才能被破壞[27]，而在飼料加工過程中，最高溫度只有(110±5)℃，還不至于破壞單端孢霉素類的化學結構，因此，加工后的飼料中仍存在單端孢霉素，這對養殖小龍蝦是一種潛在的危害。

鐮刀菌是一類機會主義病原菌，也被稱為兼性寄生病原菌，在大多數情況下以腐生的方式依附在小龍蝦上，當小龍蝦受傷后或蝦體免疫力下降時即可變成病原菌侵染小龍蝦，引發病害。尤其是生活在水體環境條件不佳或污染水體中的小龍蝦，其鰓片功能下降，嚴重時逐漸喪失呼吸功能，鰓片變黑，生長受到嚴重影響[28]。

木賊鐮刀菌是否是引起小龍蝦黑鰓病或其他病害的主要病原菌，仍需進行大量的致病性接種試驗才能確定。同時，該真菌分泌的是哪一種毒素，其對小龍蝦的毒害作用機理還有待于進一步研究。