敵百蟲對奧尼羅非魚幼魚的急性毒性及安全濃度評價

辛桂瑜 侯小露 梁敏敏 林文鋒 鄧少立 劉思妮 徐蘭程

(1玉林師范學院生物與制藥學院，廣西玉林 537000；2廣西農業職業技術學院，廣西南寧 530007)

羅非魚(Oreochromis)具有生長快、食性雜、抗病力強等優點，是聯合國糧農組織推薦的世界性優良養殖魚種之一，也是我國重要的水產養殖經濟品種[1]。奧尼羅非魚是雌性尼羅羅非魚(O.niloticus)和雄性奧利亞羅非魚(O.aureus)種間雜交獲得的雄性率較高的雜交一代[2]。該魚具有明顯的單性優勢和雜交優勢，因而成為羅非魚養殖的重要品種。然而近年來，隨著養殖規模的擴大和養殖密度的提高，養殖水質不斷惡化，導致魚類疾病頻繁暴發，嚴重制約了羅非魚養殖業的健康發展[3]。

敵百蟲，化學名稱為O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)膦酸酯，屬有機磷酯類化合物，具有高效、低毒及低殘留等特點，在水產養殖生產中常用于防治魚類的寄生蟲病[4]。敵百蟲主要起到胃毒作用，兼有觸殺作用，可防治多種害蟲，一般加工成粉劑、乳劑使用，水產上一般使用晶體敵百蟲。雖然敵百蟲在農藥中被列為低毒產品，但是魚類可經食道、呼吸系統及皮膚接觸吸收過量的敵百蟲而導致中毒[5]。

目前已有敵百蟲對多種魚類毒性作用的研究報道[6-8]，但是對奧尼羅非魚毒性作用的報道較少。由于在堿性條件下，敵百蟲脫去氯化氫會轉化成“敵敵畏”，其毒性會大大增強。因此，本試驗分別采用曝氣自來水和池塘水兩種pH不同的水，通過96 h半靜水式方法對奧尼羅非魚進行急性毒性試驗，以確定在曝氣自來水和池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的半致死濃度和安全濃度，為羅非魚養殖生產提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用奧尼羅非魚幼魚購于玉林市魚聯苗種場。試驗前將羅非魚放在盛有曝氣4 d的自來水的魚缸中暫養3 d，暫養期間充分增氧，投喂碾碎的羅非魚膨化飼料，每天飼喂2次，早晚各1次。試驗前24 h停止投飼。選擇體態正常、顏色鮮亮、健康活潑、大小一致的個體用于試驗。試驗魚體長2.8～3.0 cm，體質量0.48～0.50 g。曝氣組試驗用水為曝氣4 d以上的自來水，水溫(23.5±2.0)℃，pH為6.5，溶解氧>5 mg/L；池塘組試驗用水為養殖池塘水，水溫(23.5±2.0)℃，pH為8.5，溶解氧>5 mg/L。

1.2 試驗藥品和儀器設備

晶體敵百蟲為遠城康源獸藥有限公司產品，將其配制成質量濃度為1 mg/L的母液，試驗時按比例稀釋成所需的質量濃度[9]。試驗儀器設備有增氧機，電子天平，溫度計等，試驗用容器為容積5 L的塑料盆(上口直徑37.5 cm，下底直徑20.5 cm，高12.0 cm)。

1.3 試驗方法

參考有關資料[7-10]開展預試驗。曝氣組(A組)和池塘組(B組)各設置6個敵百蟲質量濃度，每個濃度投放10尾試驗魚，觀察24 h內試驗魚的死亡情況，得到24 h的100%死亡濃度和0%死亡濃度，以此確定藥物試驗濃度的上下限。

根據預試驗得到的試驗濃度上下限，曝氣組(A組)和池塘組(B組)按等對數間距各設置6個濃度組和1個空白對照組。曝氣組敵百蟲質量濃度為1.35、1.82、2.45、3.31、4.47、6.03 mg/L；池塘組敵百蟲質量濃度為0.01、0.14、0.21、0.31、0.46、0.68 mg/L。每個5 L塑料盆內放入10尾奧尼羅非魚。試驗期間不投飼，每24 h更換1次試驗藥液，發現有死亡的試驗魚及時撈出。試驗開始8 h后，定時觀察試驗魚的中毒情況及死亡癥狀[10]，并記錄24、48、72、96 h魚的死亡數量。如試驗魚長時間無肉眼可見動作，用小鑷子夾住魚的尾柄部，其對外界刺激無反應即可判斷該魚已經死亡。

1.4 數據處理

試驗數據采用EXCEL軟件進行處理，分別建立不同暴露時間(24、48、72、96 h)敵百蟲質量濃度與奧尼羅非魚死亡率之間的線性回歸方程，根據回歸方程分別計算奧尼羅非魚在相應暴露時間的半致死濃度(LC50)[11-13]。

安全濃度(SC)的計算公式[14]如下。

SC=0.1×96 h LC50

(1)

2 結果和分析

2.1 曝氣自來水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的急性毒性

試驗期間觀察發現，對照組的奧尼羅非魚一直表現正常。6個試驗組的奧尼羅非魚起初活動情況均為正常，8 h后，A3、A4組奧尼羅非魚開始表現異常，游動變緩，慢慢地在水面漂游，魚體或靜臥或側臥，逐漸失去平衡，尾部緩緩擺動，嘴巴慢慢張合，A5、A6組試驗魚中毒表現較為明顯，出現興奮狀態，狂游亂竄，活動劇烈，不時撞擊塑料盆壁；12 h后，A3、A4、A5、A6組奧尼羅非魚均呈現出興奮狀態，開始毫無目的地急速游動，魚體漸漸失去平衡。隨著試驗時長增加，中毒的奧尼羅非魚出現抽搐現象，呼吸停止，最后側翻死去，漂浮在水面。死亡后的奧尼羅非魚身體僵直，體色變黑，眼球突出并出現白色薄膜，鰓蓋出血，鰓蓋和口部張開。

曝氣自來水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的毒性試驗結果見表1。對照組沒有出現死亡，A1、A2組在24、48 h沒有出現死亡，72 h出現死亡，A3、A4、A5、A6組在24 h出現死亡，而敵百蟲質量濃度最高的A6組24 h試驗魚即全部死亡。

將試驗結果使用EXCEL軟件做線性回歸處理。以x為藥物的質量濃度，y為死亡魚尾數，得到線性回歸方程，并計算出敵百蟲對奧尼羅非魚的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，結果見表2。

由表2可見，在同樣的試驗時長內，敵百蟲質量濃度越高，對奧尼羅非魚的毒性就越大，奧尼羅非魚的死亡率越高；同一質量濃度下，試驗時間越長，奧尼羅非魚死亡率越高。結果顯示，曝氣自來水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質量濃度分別為3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全質量濃度為0.157 mg/L。

2.2 池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的急性毒性

試驗期間，對照組的奧尼羅非魚表現正常，沒有出現死亡。池塘水樣采集時間為16：00，池塘水24 h內pH的變化范圍為8.5～7.8，呈緩慢降低趨勢。試驗開始時，6個試驗組的奧尼羅非魚活動情況均正常，8 h后，B1、B2、B3組試驗魚開始表現異常，游動變得緩慢，魚體靜臥或側臥，在水面漂游，開始失去平衡，尾部緩緩擺動，嘴巴慢慢張合；B4、B5、B6組試驗魚中毒表現較為明顯，出現興奮狀態，狂游亂竄，游動劇烈，不時地撞擊塑料盆，此時測得水體pH為8.2。12 h后，pH降為8.0，B3、B4、B5、B6組試驗魚表現出興奮狀態，毫無目的地急速游動，魚體逐漸失去平衡，在水中翻滾。隨著試驗時長增加，中毒的奧尼羅非魚開始抽搐，停止呼吸，最后側臥死去，漂浮于水面。死亡后的魚體僵直，體色變白，眼球突出并出現白色薄膜，鰓蓋出血，鰓蓋和口部張開。

表1 曝氣自來水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚幼魚的毒性試驗結果

表2 曝氣自來水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚幼魚的半致死濃度(LC50)及其安全濃度(SC)

表3 池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚幼魚的毒性試驗結果

池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的毒性試驗結果見表3。對照組沒有死亡，B1組在24 h、48 h均沒有試驗魚死亡，72 h試驗魚出現死亡。B2、B3、B4、B5、B6組在試驗開始后24 h試驗魚就出現死亡，而敵百蟲質量濃度最高的B6組，24 h試驗魚即全部死亡。

將試驗結果使用EXCEL軟件做線性回歸處理。以x為藥物的質量濃度，y為死亡魚尾數，得到線性回歸方程，并計算出敵百蟲對奧尼羅非魚的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，結果見表4。

由表4可見，在同樣的試驗時長內，敵百蟲質量濃度越高，對奧尼羅非魚幼魚的毒性就越大，魚的死亡率越高；同一質量濃度下，試驗時間越長，奧尼羅非魚死亡率越高。結果顯示，在池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質量濃度分別為0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，其安全質量濃度為0.013 mg/L。

表4 池塘水水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚幼魚的半致死濃度(LC50)及其安全濃度(SC)

3 討論

3.1 敵百蟲對魚類的毒性機理

有研究表明，給藥3 h后，敵百蟲的濃度在大腦組織中是最高的，然后會集中于脊髓和肌肉組織[15]。有資料表明，如魚類長期接觸低濃度的敵百蟲，不但體內膽堿脂酶的活性會被抑制，而且還會損害肝、腎及體內細胞的遺傳物質。敵百蟲對水生動物的殺滅作用是其水解產物“敵敵畏”所致。“敵敵畏”是1種膽堿脂酶抑制劑，能抑制生物體內膽堿脂酶的活性，使機體失去水解破壞乙酸膽堿的能力，進而使魚類、昆蟲、甲殼類等生物神經失常而死亡。此外，敵百蟲還能使魚體的周圍神經系統麻痹，發生遲發性神經病變[16]。在本試驗中，奧尼羅非魚表現出明顯的運動失常，出現了狂游、亂竄、失去方位感及無法控制身體等癥狀，與一些文獻資料中報道的相符。

3.2 敵百蟲與水體pH的關系

敵百蟲是1種高效低毒類殺蟲劑，在漁業生產中被廣泛使用。但敵百蟲在殺死敵害生物的同時，對養殖魚類也有一定的毒害作用，特別是在堿性條件下，敵百蟲脫去氯化氫會轉化成“敵敵畏”，其毒性增加10～15倍。敵百蟲脫去氯化氫轉化為“敵敵畏”的過程隨著水體pH的升高而加快[17]。在本試驗中，曝氣自來水與池塘水在pH上有明顯的差別，曝氣自來水24 h內的pH保持在6.5左右，而池塘水試驗開始24 h內的pH在7.8～8.5。試驗結果顯示，在池塘水條件下敵百蟲的安全濃度(0.013 mg/L)明顯要低于曝氣自來水條件下的安全濃度(0.157 mg/L)，二者相差約12倍，因此，在池塘養殖生產中使用敵百蟲時應根據水體的pH嚴格控制使用濃度。養殖水體的pH往往會不斷變化，如敵百蟲使用時機不當會導致養殖魚類死亡。此外，敵百蟲對奧尼羅非魚的急性毒性還應考慮水溫、溶解氧、魚體大小等因素，本試驗測得的半致死濃度和安全濃度結果在生產上僅作參考。

3.3 “敵敵畏”對魚類的毒性機理

“敵敵畏”由敵百蟲脫去氯化氫轉化而成，是1種神經性殺蟲劑，其作用機制主要是通過抑制腦突觸體膜上的腺苷，使突觸體膜上的乙酰膽堿酯酶等神經遞質大量聚集，從而使腦乙酰膽堿酯酶被抑制[18-19]。“敵敵畏”對魚類作用的研究報道較少。根據報道[20-22]，“敵敵畏”對鯽魚幼魚48、72、96 h的半致死濃度分別為45.1、30.4、23.3 mg/L，安全濃度為2.3 mg/L；對金魚24、48、72、96 h的半致死濃度分別為39.17、33.65、27.10、25.94 mg/L，安全濃度為2.5 mg/L；對草魚的96 h半致死濃度為21.9 mg/L，安全濃度為2.19 mg/L。本試驗結果表明，在池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的96 h半致死濃度為0.13 mg/L，安全濃度為0.013 mg/L，說明奧尼羅非魚對敵百蟲的耐受能力較差，因此對“敵敵畏”的耐受能力也差，少量的“敵敵畏”就可能導致奧尼羅非魚死亡。

3.4 敵百蟲的安全使用方法

本試驗結果表明，在池塘水條件下奧尼羅非魚幼魚對敵百蟲較敏感，其安全濃度僅為0.013 mg/L，與曝氣自來水條件下得出的安全濃度相差12倍左右。所以，作為奧尼羅非魚的魚病防治藥物，使用敵百蟲時應當嚴格控制用量，在使用前應進行測試。根據敵百蟲對魚類毒性的作用規律，其毒性隨著水體pH的升高而加強，因此在生產中使用敵百蟲治療魚病或控制浮游生物時，應根據水體pH的變化調整其使用劑量。由于光合作用，池塘水體的pH具有明顯的晝夜變化規律，表現為早晨(4：00—8：00)較低，下午(14：00—16：00)較高，pH變化范圍為7.8～8.5。因此，施用敵百蟲最好選擇在晴天早晨6：00或晚上22：00進行。通常在晴天的早晨，浮游植物光合作用較弱，水體pH較低，傍晚pH又開始下降，至翌日凌晨降至最低。因此，在晴天早晨6：00或晚上22：00施藥，敵百蟲能逐漸發揮作用并逐步降解，至pH達到高峰時，敵百蟲已基本降解完畢，不易形成突發性“敵敵畏”高峰。此外，還必須考慮敵百蟲的累積作用，一般水體pH越低，敵百蟲殘留的時間越長[23]。因此，養殖池塘中不能在短時間內反復多次使用敵百蟲，施用敵百蟲后也不能施放堿性的藥物或水體改良劑，以免水體pH突然升高。

4 結論

本試驗在水溫(23.5±2.0)℃、溶解氧>5 mg/L的條件下，分別研究了曝氣自來水(pH為6.5)和池塘養殖水(pH為8.5)中敵百蟲對奧尼羅非魚的急性毒性效應。結果表明，在曝氣自來水條件下，敵百蟲對奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死濃度質量分別為3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全質量濃度為0.157 mg/L；在池塘水條件下，敵百蟲對奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質量濃度分別為0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，安全質量濃度為0.013 mg/L。在池塘水條件下敵百蟲對奧尼羅非魚的毒性比在曝氣自來水中強，其安全濃度也相差約12倍，這一結果可為奧尼羅非魚養殖及水生毒理效應試驗提供參考。