表面活性劑對瓊式不動桿菌LH-1-1降解溴氰菊酯的影響

吳敏 唐潔 胡瓊 雷丹 張慶

（1. 西華大學食品與生物工程學院，成都 610039；2. 西華大學食品與生物工程學院古法發酵生物技術研究所，成都 610039）

溴氰菊酯（Deltamethrin，DM）屬二代（II型）擬除蟲菊酯類殺蟲劑，具有低毒、高效和持久性低的特點，在農業和林業中廣泛使用［1］。但隨著DM的大范圍使用和有關擬除蟲菊酯農藥檢測技術的進一步提高，DM殘留問題逐漸暴露。研究發現其對多種水生生物具有神經、心血管和生殖毒性［1-3］。面對日趨嚴重的殘留問題，微生物修復因其高效、無毒、無二次污染，易于操作，成本低等優點成為解決DM殘留問題的首選方法［4-6］。但由于DM是一種疏水性有機物，不容易被微生物菌株吸附并降解。為了增加疏水性污染物的溶解，增大其與微生物的接觸機會，從而提高其生物降解率，表面活性劑強化微生物降解修復是一個有效的方法［7-8］。近年來，已有大量表面活性劑用于疏水性污染物的生物修復中，證實在β-氯氰菊酯［5，9］、柴油［10］、苯酚［11］、染料［12-13］、石油［14］、正己烷［15］、菲［16-17］及DDT［18］等的生物降解體系中添加表面活性劑對提高生物修復效率十分有效。但表面活性劑在DM生物降解中的應用還鮮見報道，因此具有研究意義。

黃敏等［14］、姜霞等［19］、Zhong等［20］的研究表明不同類型的表面活性劑不僅可影響疏水性污染物的溶解度，還可能對菌株的生長呈現抑制作用，進而影響污染物的降解效率。因此對表面活性劑的類型選擇是重要的。Tween-20是被廣泛用于制藥和食品等工業的乳化劑，CTAB和AES是洗化產品的主要成分，也廣泛存在于生活環境中。此外，王為中等［21］測定水體中DM殘留量時，在萃取體系中加入Tween-20提高了DM的萃取率；Ahmad等［22］利用CTAB改性膨潤土（CTAB-BT）能顯著提高對DM的吸附作用。因此，選擇上述3種表面活性劑作為研究對象。

黃敏等［14］、Wei等［15］的研究表明在表面活性劑的不同CMC作用下，對微生物降解疏水性污染物的效果有較大差別。CMC是表面活性劑發揮增溶作用的重要指標，是DM能否與菌株更好接觸的關鍵。當表面活性劑濃度稍大于CMC時會形成具有疏水內核的膠束，此時才能有效增強疏水性污染物在水中的溶解度，促使污染物與微生物更好的接觸與吸附，從而提高生物修復效率［7，10，16，23］；有研究表明，當表面活性劑濃度為CMC時，菌株對促進苯酚的降解達到最佳效果［11］。而且CMC易受到電解質、溫度、表面活性劑結構、增溶物結構等影響［24］，故在DM同一降解體系中測定表面活性劑的CMC，以確定其最佳添加量是尤為重要的。

綜上，本研究采用前期篩選到具備DM較高降解能力的Acinetobacter juniiLH-1-1為目標菌株，通過熒光光譜法測定了DM同一降解體系中陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、陰離子表面活性劑脂肪醇醚硫酸鈉（Fatty alcohol ether sulfate，AES）非離子表面活性劑聚氧乙烯（20）山梨醇酐單月桂酸酯（Tween-20）的CMC，并進一步探討了3種表面活性劑在各CMC對菌株生長、DM增溶作用和菌株降解DM的影響，以期為表面活性劑在DM的高效生物降解中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 瓊式不動桿菌LH-1-1（A. juniiLH-1-1）：本實驗室前期從長期受擬除蟲菊酯類農藥污染的草莓根系土壤中篩選得到，培養96 h對75 mg/L的DM降解率達到82.36%［25］；保存于西華大學食品與生物工程學院微生物實驗室。

1.1.2 培養基 Luria-Bertani（LB）培養基、最佳降解培養基（Optimal medium，OM）［25］；LB-DM培養基、OM-DM培養基：分別向LB培養基和OM培養基中加入一定量DM母液制成，使DM最終濃度為75 mg/L，121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將菌株LH-1-1接種至LB培養基，30℃、180 r/min振蕩培養48 h后轉接至LB-DM培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養48 h。將培養液于4℃、10000 r/min離心10 min，收集沉淀菌體，以無菌生理鹽水重懸，調整菌體細胞濃度，制成OD600≈1.0的菌懸液。

1.2.2 DM的檢測 樣品處理、檢測方法：參照胡瓊等［25］的方法。

1.2.3 臨界膠束濃度的測定 測定方法［26-27］：溶劑為甲醇，配制濃度為4×10-3mol/L的芘溶液；用OM培養基分別配制50 mmol/L濃度的CTAB、AES和Tween-20溶液。分別吸取0.1 mL芘溶液于10個100 mL容量瓶，待甲醇揮發后加入不同體積的CTAB、AES和Tween-20溶液，用OM培養基定容，使芘的最終濃度為4×10-6mol/L，配制10 個不同濃度的CTAB、AES和Tween-20溶液（0.004、0.06、0.2、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0和14.0 mmol/L）。將所有樣品超聲混勻30 min后，于35℃水浴20 min，室溫靜置過夜，測定各體系的熒光光譜。重復3次。

1.2.4 表面活性劑對菌株LH-1-1生長的影響 分別 配 制 一 系 列 含CMC（0、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和5.0 CMC）表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）的OM培養基，以不含表面活性劑的OM培養基作為空白對照，每組實驗重復3次。分別將200 mL OM培養基裝入500 mL錐形瓶中，接入1.0 mL菌懸液，于30℃、180 r/min振蕩培養定時取樣測定生物量（以OD600表示）。

1.2.5 表面活性劑對DM增溶作用的影響 分別配制一系列含CMC（0、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和5.0）表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）的OM培養基，取5 mL裝于 50 mL錐形瓶中，加入1.0 mg DM，40 kHz、300 W超聲輔助溶解30 min，30℃、180 r/min振 蕩24 h，10000 r/min離 心10 min，去除沉淀（未溶解DM）。HPLC法檢測上清液中DM含量，即DM在不同表面活性劑溶液中的溶解度。以加入5 mL OM培養基溶解DM的樣品作為空白對照，每組實驗重復3次。

1.2.6 表面活性劑對菌株LH-1-1降解DM的影響 分別配制一系列含CMC（0、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和5.0）表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）的OM培養基，以不含表面活性劑的OM-DM培養基做陽性對照，不接種菌懸液而接入等體積無菌水的OM-DM培養基做陰性空白對照，每組實驗重復3次。分別將25 mL OM-DM培養基裝于50 mL錐形瓶中，接入體積分數為5%菌懸液，30℃、180 r/min振蕩培養72 h。HPLC法測定培養液中的DM含量，按下式計算DM降解率。

式中：C0為未接入菌懸液的培養基中DM的含量；C為接入菌懸液的培養基中DM的含量

2 結果

2.1 臨界膠束濃度的測定

芘在不同濃度的表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）溶液中經335 nm的光激發后的熒光光譜如圖1所示，橫坐標為熒光發射波長（λ），縱坐標為熒光光強（I）。373 nm處峰的熒光強度I1和384 nm處峰的熒光強度I3之比強烈依賴于體系的極性，故可用I1/I3值表示體系的微極性，并用于表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）CMC的測定。

用I1/I3比值與（CTAB、AES和Tween-20）濃度的負對數-lnc作圖，得到I1/I3隨-lnc變化關系曲線（圖2）。從圖中可看出當表面活性劑濃度較低時（低于CMC），I1/I3的比值基本不變，此時表面活性劑分子在溶液中幾乎以單體形式存在，膠束聚集體數量極少；但隨著表面活性劑濃度大于CMC時，其在溶液中以膠束形式存在，I1/I3值發生突變。所以分別從高、低濃度兩端作曲線的切線，得到2條切線的交點即為CMC。得到CTAB、AES和Tween20的CMC分別0.793 mmol/L、0.547 mmol/L和0.031 mmol/L。

圖2 I1/I3隨-lnc（底物）變化曲線

2.2 表面活性劑對菌株LH-1-1 生長的影響

菌株的生物量是降解DM的重要因素之一，得到不同CMC表面活性劑的培養基中菌株LH-1-1的OD600值如圖3所示。低濃度陽離子表面活性劑CTAB對菌株的生長略有促進作用；陰離子表面活性劑AES對菌株生長有抑制作用，不利于菌株LH-1-1生長，且隨著表面活性劑濃度的增加抑制作用更加顯著；高濃度的非離子表面活性劑Tween-20對微生物的生長有一定的促進作用。

2.3 表面活性劑對DM增溶作用的影響

DM在3種不同類型表面活性劑溶液中的溶解度，如圖4所示。當表面活性劑濃度小于CMC時膠束未形成，表面活性劑對DM增溶作用不明顯。在1-2 CMC的條件下DM增溶效果最為明顯，且隨著表面活性劑濃度增加DM的溶解度增大，其中CTAB增溶效果最好，當CTAB濃度為2 CMC和5 CMC時，DM溶解度分別達到16.24 mg/L和17.43 mg/L，分別促進了14.56 mg和15.75 mg的DM溶解（空白組DM溶解度為1.68 mg/L）；Tween-20增溶效果次之，在5 CMC時，溶解度為14.35 mg/L；AES增溶效果最差，在5 CMC時，溶解度為9.86 mg/L。

2.4 表面活性劑對菌株LH-1-1降解DM的影響

培養72 h時各CMC表面活性劑培養液中菌株LH-1-1對DM的降解率，如圖5所示。從圖中可以看出，含有CTAB的培養基中菌株對DM的降解能力最高；CTAB含量在1.5 CMC、2 CMC、5 CMC時DM降解率分別為96.89%、98.20%和98.54%，隨著CTAB含量的增加，DM降解率也隨之提高。綜合經濟成本和環境保護考慮，CTAB含量在2 CMC時降解效果最好，且較未添加表面活性劑的陽性對照組（73.89%）降解率提高了24.31%。Tween-20對菌株降解DM影響較小，在較高CMC時有略有促進作用。而含有AES的培養基中DM降解率較空白低，且隨著AES含量的增大，抑制作用更明顯。

3 討論

DM在環境中累積的毒性引起廣泛關注，要對污染的環境進行有效的生物修復，除了對降解污染物的微生物進行探索和研究外，通過添加適宜濃度的表面活性劑利用其增溶等作用輔助去除環境中難降解、難被利用和難溶的污染物，增加污染物的生物利用度用于改善其生物降解也十分重要［28-30］。當體系中表面活性劑濃度大于CMC時，溶液中才會形成具有疏水內核的膠束，從而增大DM在水溶液中的溶解度［7］。但CMC受諸多環境因素的影響，為保證實驗研究的準確性，本研究通過熒光光譜儀測定了3種表面活性劑的CMC，得到CTAB、AES和Tween-20的CMC分 別 為0.793 mmol/L、0.547 mmol/L、0.031 mmol/L。

圖3 表面活性劑對菌株LH-1-1生長的影響

圖4 表面活性劑對DM的增溶作用

圖5 表面活性劑對DM降解的影響

同時，探究了3種不同類型表面活性劑各CMC對A. juniiLH-1-1生長、DM增溶作用和菌株降解DM的影響。本研究結果顯示各CMC的CTAB對菌株的生長無明顯影響；AES對菌株生長有抑制作用，不利于菌株LH-1-1生長，且隨著表面活性劑濃度的增加抑制作用更加顯著，可能是這種陰離子表面活性劑使培養基環境中的電荷密度發生改變，從而導致微生物細胞膜變性，影響微生物的正常分裂繁殖［5］；高濃度Tween-20對菌株的生長有一定的促進作用，可能是微生物優先利用Tween-20作為生長的能源物質［5］。同時CTAB、AES和Tween-20對DM均具有較強的增溶作用，且隨著表面活性劑含量增加，DM溶解度也隨之增加，這與疏水性染料溶解度隨表面活性劑濃度的增大而增加的趨勢是一致的［31］。其中CTAB對DM的增溶作用最明顯，可能是由于稍高濃度的CTAB對DM具有較強的增溶作用，同時對菌株生長無顯著影響，增加了DM與菌株之間的接觸，DM的可利用度增加，故而降解率更高［28］。也可能是因為在3種表面活性劑中，CTAB的直鏈烷烴鏈最長，有利于膠束聚集數的增大，從而形成體積更大的膠束，對疏水性污染物的溶解能力更好［24］；Wei等［15］和Lee等［32］的研究結果也表明具有較長直鏈疏水烷基鏈的表面活性劑，對疏水性污染物的增溶和吸附作用最顯著。González等［33］研究證明在土壤中添加CTAB能更好地溶解農藥；Lu等［34］的調查研究也證明在稻田中加入陽離子表面活性劑十二烷基溴化吡啶（1-Dodecylpyridinium bromide，DDPB）會促進多環芳烴物質溶解；閆瑞和余暉等［35］研究也表明季銨鹽型陽離子表面活性劑對多環芳烴菲和芘有較好的增溶效果。

本實驗在菌株LH-1-1降解DM的體系中添加2 CMC陽離子表面活性劑CTAB，可明顯促進菌株對DM的降解，培養72 h 對75 mg/L DM的降解率達到98.20%，且降解率隨表面活性劑濃度的增加而增大。目前已有報道多食鞘氨醇桿菌SW（Sphingobacterium multivorum）培養120 h 對1.0 mg/L DM的降解率為76.4%［4］；賴氨酸芽孢桿菌ZJ6（Lysinibacillussp.）培養7 d 可降解57.2%濃度為100 mg/L-200 mg/L的DM［6］；蠟狀芽孢桿菌Y1（Bacillus cereus）96 h對100 mg/L DM降解率為22.8%［36］；嗜麥芽寡養單胞菌XQ08（Stenotropomonas maltophilia）培養5 d 對50 mg/L DM的降解率為66.7%［37］；陰溝腸桿菌X09（Enterobacter cloacae）和熒光假單胞菌X20（Pseudomonas fluorescens）培養96 h對50 mg/L DM降解率分別為65%和69.3%［38］；假單胞菌屬DE29（Pseudomonassp.）培養7 d 對100 mg/L DM的降解率為96.32%［39］。本研究結果說明添加表面活性劑不僅能提高DM的降解率，也縮短了DM降解所需時間，為高效生物修復DM污染環境奠定重要的實驗理論基礎。表明表面活性劑在生物修復受擬除蟲菊酯類農藥污染的環境方面具有一定的應用價值，且其作用機理等也值得進一步研究。

4 結論

本研究測定了3種不同類型表面活性劑（CTAB、AES和Tween-20）在同一DM降解體系中的CMC分別 為0.793 mmol/L、0.547 mmol/L和0.031 mmol/L。在各CMC條件下發現CTAB對A. juniiLH-1-1的生長無明顯影響，AES對菌株生長有抑制作用，Tween-20對A. juniiLH-1-1的生長有一定的促進作用；CTAB、AES和Tween-20對DM均具有較強的增溶作用；其中CTAB可顯著提高A. juniiLH-1-1對DM的降解率，當其含量為2 CMC，72 h時DM降解率達到98.20%，較未添加表面活性劑的對照組（陽性）降解率提高了24.31%。