RNA干擾技術在昆蟲學領域研究進展

徐雪亮 王奮山 劉子榮 范琳娟 季香云 蔣杰賢 姚英娟

（1. 江西省農業科學院農業應用微生物研究所，南昌 330200；2. 上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403）

1 RNAi沉默基因機制

RNAi是由外源雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介導引起的目的基因mRNA沉默的現象［1］。自Fire等［2］1998年首次報道了注射外源dsRNA可造成秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）內源性mRNA沉默的現象以來，RNAi已迅速成為研究基因功能、調控和有機體層面的反向遺傳學技術手段。隨著RNAi技術的快速發展與應用，其在病蟲害防治管理方面也顯示出了巨大的潛力，并在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目及鱗翅目等許多昆蟲中已經得到了成功應用［3］。

目前已知動物中存在3種不同類型的小RNA可以觸發相應的RNAi通路。第一種是由短/小干擾RNA（Short/small interfering RNA，siRNA）調控的siRNA通路，siRNA由外源或內源的dsRNA加工為長度一般為19-21 bp的dsRNA；第二種是由微小RNA（MicroRNA，miRNA）調控的miRNA通路，miRNA是長度21-24 bp的單鏈非編碼RNA；第三種是與PIWI（P-element induced wimpy testis）蛋白相互作用的小RNA（piRNA）調控的piRNA通路，piRNA是長度23-36 bp的單鏈RNA［4］。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的dsRNA時，該mRNA發生斷裂而導致基因表達沉默。當dsRNA（外源或自身產生）進入細胞后，首先由RNaseIII核酸酶家族的Dicer與dsRNA結合，隨后dsRNA被降解成19-21 bp長度的小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA），然后siRNA與RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結合，再解旋成單鏈RNA，并由該復合體主導RNAi效應［5］。RISC被活化后，受siRNA引導（Guide-strand），通過堿基互補配對特異性地結合在同源mRNA（靶標）上，切斷標靶mRNA，引發靶標mRNA的分解，從而引發目標基因的表達沉默。

2 雙鏈RNA的轉運機制

一般來說，dsRNA進入生物體內后才能誘導RNA干擾反應。目前有兩種潛在的機制：秀麗隱桿線蟲體內跨膜通道介導的途徑和果蠅S2細胞通過吞噬作用的途徑。昆蟲對dsRNA的攝取是高度復雜的，這不僅是因為不同物種可能有不同的機制，還因為同一物種可能依賴于多種機制。在昆蟲研究中，最基本的將dsRNA導入昆蟲體內的方法主要包括顯微注射法、飼喂法、浸泡法和轉染法。近些年來，各種各樣的技術被開發并納入這些基本的方法中，包括陽離子脂質體輔助、納米顆粒激活、共生體介導和植物介導的傳遞［6］。

2.1 顯微注射法

顯微注射法是應用最普遍的傳遞dsRNA的方法［7］，將少量的dsRNA加入適當的溶液中直接注射到昆蟲胚胎或體內［8-9］。1998年，Kennerdell和Carthew［10］用顯微注射的方法將果蠅翅形成基因frizzled和frizzled2的dsRNA注入胚胎中，分別得到這兩個基因的缺陷型，首次實現了顯微注射dsRNA來研究昆蟲基因的功能。

2.2 飼喂法

飼喂法是與實際生產實踐相結合的一種重要方法，在昆蟲的食物或者人工飼料中加入靶標基因的dsRNA，dsRNA隨著昆蟲取食進入體內而達到導入dsRNA的目的。dsRNA的喂食主要方式：一是在微生物中表達dsRNA，供昆蟲取食，成功應用微生物的有大腸桿菌［11］和釀酒酵母［12］；二是在體外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接給昆蟲食用。

2.3 浸泡法

浸泡法是指將溶有dsRNA的液體浸泡或者噴灑于昆蟲的體表或者受精卵，從而達到靶標基因沉默的一種方法。第一例浸泡法的實驗是在線蟲中實現的，直接將線蟲浸泡在含有dsRNA的溶液中，成功實現了RNA干擾［13］。在昆蟲中，使用這種方法主要在細胞株中實施［14］。

2.4 轉染法

轉染法通過轉染劑將dsRNA直接傳送到細胞內，比之浸泡法，轉染法可以更有效地將dsRNA轉運到細胞中［15］。Whard等［16］在果蠅幼蟲上測試了TransFectin、DMRIE-C、Cellfectin和Lipofectamine 2000等幾種轉染試劑，轉染法導致靶標基因表達下調了31%-52%，而浸泡法僅下調了5%-8%，說明轉染法有利于蟲體對dsRNA的吸收，更有效地實現RNAi效果。

2.5 轉基因植物法

轉基因植物法是指通過轉基因技術讓植物自身表達靶標基因的dsRNA，昆蟲取食植物的同時攝入dsRNA，可以沉默昆蟲體內特定靶標基因的表達，導致其生長發育異常甚至死亡從而達到防控害蟲的作用［17］。

3 RNAi技術在不同目昆蟲中的應用

3.1 RNAi技術在雙翅目昆蟲中的研究進展

雙翅目腹黑果蠅是昆蟲領域被普遍用于科學研究的最主要的一種模式昆蟲。合成寬帶果實蠅Zeugodacus scutellata一個雌成蟲高度表達的性別決定基因Transformer-2（Zs-Tra2）的dsRNA，通過向幼蟲顯微注射或者飼喂可表達該dsRNA的大腸桿菌細胞，可顯著增加雄蟲的比例［18］。Zeng等［19］研究報道了利用顯微注射儀將蚊子氣味受體基因dsRNA注入致倦庫蚊雌蛹，然后通過排斥性生物活性測定試驗篩選出了介導驅避對于特異植物源化合物的氣味受體。通過飼喂dsRNA沉默遲眼蕈蚊一個A型谷胱甘肽S轉移酶基因BoGSTd2的表達水平，降低了毒死蜱和噻蟲胺誘導的活性氧的清除能力，從而增強了遲眼蕈蚊對毒死蜱和噻蟲胺的敏感性。說明BoGSTd2基因在毒死蜱和噻蟲胺解毒中起重要作用，保護遲眼蕈蚊組織不受這些殺蟲劑誘導的氧化應激的影響［20］。白紋伊蚊卵黃蛋白基因Vitellogenin-2（Vg-2）的高表達水平與糖喂養的雌蚊最低的求偶活動相關。通過RNA干擾敲除Vg-2基因恢復了雌蚊的求偶行為，證明白紋伊蚊Vg-2基因表達在調節求偶行為中起著關鍵作用［21］。

3.2 RNAi技術在鞘翅目昆蟲中的研究進展

科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）（Say）是一種主要的茄科作物害蟲，MDR基因是一類編碼ABC跨膜轉運蛋白B亞家族（ABCB轉運蛋白）的多藥抗性基因。Favell等［22］將可表達多藥抗性MDR基因dsRNA的細菌涂抹馬鈴薯葉片飼喂幼蟲，MDR基因的表達量相對于對照顯著降低了90%以上，生物活性測定試驗結果顯示成蟲的存活率與對照相比無顯著差異，說明馬鈴薯甲蟲的MDR轉運蛋白與伊維菌素的解毒作用無關。茄二十八星瓢蟲是蔬菜上危害最嚴重的害蟲之一。讓瓢蟲幼蟲和成蟲取食涂抹表達dsHvSnf7細菌的龍葵葉片，可導致1齡幼蟲、2齡幼蟲和成蟲的死亡率分別是98%、88%和60%，說明HvSnf7可以作為一種潛在的RNAi的靶標基因用于防控茄二十八星瓢蟲［23］。胰島素/胰島素樣生長因子（Insulin/insulin-like growth factor，IGF）信 號（Insulin/insulin-like growth factor signaling，IIS）是昆蟲在營養依賴條件下的性選擇武器生長的潛在的一種主要生理機制。然而，營養狀態與武器生長相結合的分子機制仍是未知的。Okada等［24］注射胰島素肽類基因GcorILP2的dsRNA可減小廣角面粉甲蟲Gnatocerus cornutus雄蟲下頜骨的大小，說明GcorILP2基因參與調控廣角面粉甲蟲武器的生長。Pinheiro等［25］通過顯微注射法和飼喂法轉運4個靶標基因（Prosα2、RPS13、Snf7和V-ATPase A）的dsRNA進入斯里蘭卡象鼻蟲成蟲體內發現，兩種轉運方式均能觸發穩定的RNAi反應，這表明基于RNAi技術可以開發一種可選擇性的相對環境安全的控制這種害蟲的策略。

3.3 RNAi技術在膜翅目昆蟲中的研究進展

經過改造蜜蜂腸道一種共生菌Snodgrassella alvi wkB2，使其可以持續產生dsRNA，調控宿主基因表達，保護蜜蜂免受病原體和寄生蟲侵害［26］。黃瘋蟻（Nylanderia fulva）是美國一種新的入侵害蟲，以高繁殖和形成超級群體的能力對當地生態環境為害嚴重。科研工作者將可表達NfCOPβ（參與蛋白質轉運基因）和NfArgK（細胞能量儲備調節基因）dsRNA的細菌加入人工飼料供工蟻取食，導致螞蟻的存活率相對于對照顯著降低了15%［27］。蝶蛹金小蜂淀粉酶基因PpAmy1在其消化道高度表達，利用RNAi技術沉默該基因可顯著地縮短成蟲壽命［28］。在蜜蜂中，雙鏈RNA（dsRNA）和小干擾RNA（siRNA）均能顯著減少靶向基因的表達水平，研究表明siRNA混合對酪胺受體tyr1基因沉默效率優于dsRNA，并且dsRNA與siRNA的敲除時間長短不同［29］。將合成的葉蜂Ardsx基因dsRNA注射入幼蟲腹部，通過形態學觀察發現雄蜂生殖器官產生了嚴重缺陷［30］。

3.4 RNAi技術在半翅目昆蟲中的研究進展

新熱帶棕色椿象Euschistus heros是南美洲大豆生產中一種最主要的害蟲，其轉錄組測序分析鑒定RNA干擾的核心基因發現缺乏sid-like基因，并通過注射dsRNA并進行實時熒光定量PCR檢測siRNA機制的有效性。最后設計靶向V-ATPase-A基因的dsRNA，顯微注射96 h后成蟲的死亡率為35%，說明盡管缺乏sid-like基因，顯微注射dsRNA仍然具有RNAi效果［31］。向棉粉蚧成蟲和蛹注射DNA甲基轉移酶基因PsDnmt1A和PsDnmt1B的小干擾RNA，24 h和72 h后這兩個基因的表達水平均顯著下降，導致雌成蟲死亡和體色異常，還造成雄成蟲翅發育異常。結果表明，DNA甲基轉移酶基因在調節棉粉蚧雌雄異形方面起著關鍵作用［32］。Chen等［33］將合成的兩個味覺受體基因NlGr10a和NlGr10b的dsRNA，注射入羽化1 d的褐飛虱雌成蟲體內，結果發現dsNlGr10a不會影響NlGr10b的表達量。NlGr10a和NlGr10b被敲除后，褐飛虱產卵數量和孵化率分別下降了43.19%和26.14%，37.82%和10.70%。此外，NlGr10a基因敲除后的卵孵化率明顯低于NlGr10b基因敲除后的卵孵化率，說明NlGr10a和NlGr10b調節了褐飛虱的繁殖力，NlGr10a對褐飛虱繁殖力的影響強于NlGr10b。3種蚜蟲——橘蚜（Aphis citricidus）、豌豆長管蚜（Acyrthosiphon pisum）和桃蚜（Myzus persicae）的一個表皮蛋白基因CP19s序列相似度為86.6%-94.4%，但與其捕食性天敵龜紋瓢蟲的序列相似度很低。因此，設計合成CP19s基因dsRNA，用于飼喂3種蚜蟲，然后將蚜蟲幼蟲供于龜紋瓢蟲取食，結果發現3種蚜蟲CP19s基因的表達水平下降了39.3%-64.2%，導致蚜蟲的死亡率為45.8%-55.8%。同時，該基因的dsRNA對龜紋瓢蟲CP19s基因的表達水平和發育歷期均無顯著影響。結果說明這個表皮蛋白基因CP19是一個有前途的針對蚜蟲的RNAi靶點，可以通過dsRNA設計來控制蚜蟲同時對捕食性天敵無顯著不利影響，是一種有效的RNAi害蟲防治策略［34］。

3.5 RNAi技術在直翅目昆蟲中的研究進展

東亞飛蝗作為一種模式昆蟲，也是直翅目昆蟲中被研究最多的一種昆蟲。DNA甲基化在動物的行為可塑性中起著重要的作用。通過RNAi降低東亞飛蝗DNA甲基轉移酶基因Dnmt3的表達量，顯著改變了蝗蟲大腦基因表達譜，并抑制了激素受體HR3的表達，導致獨居蝗蟲的與群居和擁擠相關的移動能力顯著降低［35］。通過顯微注射東亞飛蝗的芳烴受體基因LmAhR的dsRNA，有效降低了色氨酸誘導的AhR基因的和細胞活性氧產物的表達水平，從而減弱了色氨酸對蝗蟲的致死作用［36］。在誘導滯育（短光周期）處理下，東亞飛蝗的一種神經肽FaRPs的前體基因flrf表達水平明顯高于非誘導滯育（長光周期）處理。向東亞飛蝗注射dsflrf，使其表達量降低了75.8%-89.2%，導致蝗蟲滯育率顯著下降，說明flrf基因可促進蝗蟲的滯育［37］。

3.6 RNAi技術在鱗翅目昆蟲中的研究進展

Gurusamy等［38］利用Cellfectin II轉染試劑構建的dsRNA，將其用于飼喂草地貪夜蛾幼蟲，檢測到iap基因顯著下調，導致幼蟲生長遲緩，甚至死亡，說明使用該轉染劑傳遞dsRNA可以提高草地貪夜蛾細胞和組織的RNAi效率。Br-C基因是昆蟲20-羥基蛻皮激素信號通路中一種重要基因，在昆蟲的生長過程中起著至關重要的作用。舞毒蛾4齡幼蟲取食表達LdBr-C基因dsRNA細菌的人工飼料，敲除導致幼蟲發育畸形，體重顯著下降，取食6 d后的死亡率為67.18%。同時Br-C基因的敲除還顯著下調了8個與幾丁質合成和代謝有關的關鍵基因的轉錄水平，這些結果表明Br-C基因的敲除影響舞毒蛾幼蟲的發育和幾丁質的合成［39］。向小菜蛾敏感種群幼蟲注射PxTryp_SPc1基因的dsRNA，顯著下調PxTryp_SPc1基因的表達量，降低顯著降低了酪蛋白水解和胰蛋白酶活性，使Cry1Ac原蛋白激活，從而降低了小菜蛾敏感種群對Cry1Ac原蛋白的敏感性，這說明該基因的低水平表達促進了木小菜蛾對Cry1Ac的抗性［40］。家蠶Bmsage是一種bHLH轉錄因子，參與家蠶胚期絲腺的發育。Hou等［41］合成家蠶Bmsage的dsRNA并注射入卵內沉默該基因的表達，導致絲腺的細胞數量減少，影響蠶絲的合成和產量，證明了Bmsage通過細胞周期蛋白通路調控家蠶絲腺的發育。

4 總結與展望

RNAi是現階段研究昆蟲功能基因組領域普遍應用的一種技術，尤其在昆蟲靶標基因功能方面表現出高效可靠的潛能［42］。但是，RNAi技術的應用也存在著一些問題，最主要的是多種因素的影響會降低干擾效率，導致干擾效果并不理想。首先是靶標基因的選擇，昆蟲不同基因的干擾效果并不相同。其次，不同昆蟲種類間RNAi的效果也有差異，如鞘翅目昆蟲的RNAi效果很好，而鱗翅目昆蟲的RNAi效果均不太理想［43］。再次，昆蟲體內的核酸酶可以降解dsRNA，這是對豌豆蚜進行RNAi所需要解決的一大難題［44］。此外，昆蟲不同部位組織的RNA干擾效率也不一致［45］。RNAi在病蟲害管理中的廣泛應用面臨主要問題包括：昆蟲間RNAi效率不穩定、缺乏可靠的dsRNA傳遞方法、脫靶和非靶標效應以及昆蟲種群中潛在的抗性發展等。

盡管RNAi效率受到多種因素的影響，但是該技術已成為一種被廣泛應用于研究昆蟲生長發育、生理和分子過程的強有力的工具，其對環境友好、安全及對非靶標昆蟲影響小的特點，具有成為害蟲綠色防治新策略的巨大潛力。未來，RNAi技術仍將是研究靶標基因功能的首選科研手段，隨著科學技術的不斷發展和創新，更高效率和更加快速的RNAi技術在昆蟲科學研究中尤其是在開發dsRNA殺蟲劑防治害蟲中有廣闊發展前景。