一株紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）總糖和β-葡聚糖的積累特性研究

代祿梅 李濤 吳華蓮 吳后波 向文洲

（1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣州 510301；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣州 511458；4. 中國科學院南海生態環境工程創新研究院，廣州 510301）

微藻是一種分布廣泛、種類繁多的光合生物，具有生長速度快、能吸收CO2、光合效率高，不與糧食作物競爭土地等特點［1-3］；同時，能夠合成蛋白質、糖類、油脂、色素等活性物質，在醫藥、食品、飼料、化妝品、可再生能源等領域具有很好的開發利用價值［4-5］。富含多糖的微藻是生產生物乙醇和β-葡聚糖的理想原料［6-7］。β-葡聚糖是D-葡萄糖通過β-糖苷鍵連接而成的多糖［8］，主要分布在酵母、真菌、植物和藻類中［9］。β-葡聚糖具有抗輻射、抗癌和抗腫瘤活性，以及調節機體免疫、調節血糖和降低膽固醇等功能［10-11］。目前，研究發現微擬球藻和紫球藻是β-葡聚糖的重要來源［7，12］。

營養鹽和環境因素（如鹽度、溫度、光照等）可以影響微藻生長和生物質組成［13］。研究表明，高鹽條件可誘導微藻細胞中糖類化合物的積累，如在咸水中培養的螺旋藻（Spirulinasp. LEB 18），其多糖含量是使用Zarrouk培養基時的3.3倍［14］。淡水資源的日益匱乏和可耕地面積的逐年遞減正威脅著人類社會的生存與發展，因此，利用海水資源以及大面積待開發利用的鹽堿灘涂地對微藻進行規?；囵B是一種理想的途徑。

本研究以一株新分離鑒定的、含糖量較高的紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）為實驗對象，從4種培養基中篩選出適合其生長的培養基，在此基礎上研究了不同鹽度對該藻生長、胞內多糖及β-葡聚糖積累的影響，利用平板光生物反應器進一步評價紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）戶外生產潛力，以期為紅孢囊藻多糖的高值化開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

單細胞紅藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）分離自 中 國 南 海 西 沙 海 域 水 體（111°45.000' E，16°28.471'N），現保藏于中國科學院南海海洋研究所海藻資源與生物技術實驗室。

1.2 方法

1.2.1 培養條件 微藻于300 mL（? 3.0 cm × 60 cm）柱式光生物反應器中進行培養，單側熒光燈持續24 h照明提供光源，在培養前4 d，光強逐漸從30 μmol photons/m2s增 加 至180 μmol photons/m2s，之后保持在180 μmol photons/m2s，培養溫度為（25±1）oC，培養周期16 d，連續鼔入CO2加富的壓縮空氣（1% CO2，V/V）提供碳源。

1.2.2 實驗設計

1.2.2.1 培養基優化實驗 以不同鹽度的4種培養基（改良后的f/2培養基、Conway培養基、Erdschreiber培養基和ASW培養基）對微藻進行培養。各培養基的組成如表1所示，以南海海域上層海水進行配制（鹽度為36‰左右）。在1.2.1條件下進行培養，每組設置3個平行，每2 d測定生物量，培養結束，離心收集藻泥，冷凍干燥并測定總糖和β-葡聚糖含量。

1.2.2.2 鹽度適應性實驗 以適合紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）生長的培養基為基礎培養基，分別通過補充去離子水或NaCl進行鹽度調節，設置不同的鹽度水平（10‰、18‰、28‰、38‰、48‰、58‰和68‰），研究其對該藻生長、胞內總糖及β-葡聚糖積累的影響。在1.2.1條件下進行培養，每組設置3個平行，每2 d測定生物量，離心收集藻泥，冷凍干燥并測定總糖含量和β-葡聚糖含量。

1.2.2.3 戶外培養實驗 于廣州非雨季對微藻進行戶外培養評價小試，藻細胞經室內擴種后直接接入戶外光徑為6 cm的平板式光生物反應器（長120 cm× 高120 cm，有效體積為72 L），培養時間為18 d，連續鼔入含1% CO2的壓縮空氣提供碳源和攪拌，培養前期采用遮陽布遮擋反應器，隨著藻細胞濃度增加，逐漸增加光照面積，培養周期內，白天平均氣溫為17.7±1.8℃，每2 d測定生物量，每4 d離心收集藻泥，冷凍干燥并測定總糖和β-葡聚糖含量，每天鏡檢觀察雜藻和原生動物情況。

表1 四種不同培養基成分

1.2.3 生物量測定 采用干重法進行測定。取5-10 mL藻液，通過預先稱量好的混合纖維過濾膜（0.45 μm）進行過濾，并用去離子水清洗，再將有藻細胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，用減差法得到微藻生物量干重（Dry weight，DW）。

1.2.4 總糖含量測定 取10 mg藻粉，加入5 mL 1 N H2SO4，在80oC水浴攪拌提取0.5 h，8000 r/min離心8 min，收集上清液。反復提取3-5次，合并上清液并定容至50 mL。利用硫酸苯酚法測定微藻總糖含量［15］。

1.2.5 β-葡聚糖含量測定 采用酶試劑盒“Mushroom and Yeast Beta-Glucan Assay Procedure”（K-YBGL 12/16，Megazyme，Bray，Ireland）并按照其說明書中的步驟測定β-葡聚糖含量。具體步驟如下：

1.2.5.1 總葡聚糖含量測定 稱取約90 mg藻粉于帶蓋玻璃螺口試管，加入2 mL冰浴后的12 mol/L H2SO4，冰浴2 h后，加入10 mL H2O，振蕩10 s，沸水浴2 h，冷卻至室溫后轉移至100 mL容量瓶，加入6 mL 10 mol/L KOH溶液，并用200 mmol/L NaAc緩沖液（pH5）定容至100 mL。取適量溶液于5000 r/min離心10 min，吸取0.1 mL上清液于另一干凈玻璃螺口試管中，加入0.1 mL處理過的bottle 1中溶液（含1，3-β-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，已按試劑盒說明處理），40oC水浴60 min，加入3 mL GOPOD試劑（按試劑盒說明配制），繼續于40oC水浴20 min，在510 nm測定其吸光值。

1.2.5.2 α-葡聚糖含量測定 稱取約100 mg藻粉于帶蓋玻璃螺口試管中，加入2 mL 2 mol/L KOH溶液并于冰浴攪拌20 min，加入8 mL 1.2 mol/L NaAc緩沖液（pH3.8）后，立即加入0.2 mL bottle 2（含淀粉轉葡糖苷酶和轉化酶），振蕩混勻，于40oC水浴30 min，5000 r/min離心10 min。取0.1 mL樣品液于另一干凈玻璃螺口試管中，加入0.1 mL 200 mmol/L NaAc緩沖液，加入3 mL GOPOD試劑，40oC水浴20 min，在510 nm測定其吸光值。

1.2.5.3 β-葡聚糖含量計算 利用Megazyme網站（www.megazyme.com）下載的Mega-CalcTM計算藻粉中總葡聚糖含量和α-葡聚糖含量，β-葡聚糖含量（%DW）=總葡聚糖含量（% DW）-α-葡聚糖含量（%DW）。

1.2.6 產量和產率計算

總糖產量（g/L）=Mt× Ct

總糖產率（mg/L·d）=（Mt× Ct- M0× C0）/d

β-葡聚糖產量（g/L）=Mt× Gt

β-葡聚糖產率（mg/L·d）=（Mt× Gt- M0×G0）/d

其中，Mt為收藻時微藻的生物質濃度（g/L），Ct為相對應的總糖含量（DW%），Gt為相對應的β-葡聚糖含量（% DW）；M0為接種時微藻的生物質濃度（g/L），Ct為相對應的總糖含量（% DW），Gt為相對應的β-葡聚糖含量（% DW），d為微藻培養天數。

1.2.7 統計分析 本論文中所有圖表所示的平均值和標準偏差均由3個生物學重復和3個測定重復計算獲得；采用SPSS13.0進行方差分析（ANOVA）和t檢驗；檢驗水平α=0.05，P＜0.05差異有統計學意義；數據處理和圖表制作使用Origin 8.1。

2 結果

2.1 不同培養基對紅孢囊藻（Rhodosorus sp.SCSIO-45730）生長的影響

如圖1所示，培養周期0-4 d，紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）在4種培養基中的生長無明顯差異（P＞0.05），而在第4天后，逐漸出現差異。至培養結束（第16天），ASW培養基中的微藻獲得最大生物量，為（9.50 ± 0.13）g/L，顯著高于其他3個處理組（P＜0.01）；微藻在Conway培養基和Erdschreiber培養基中生物量分別為（7.15 ±0.07）g/L和（6.29 ± 0.12）g/L；而其在f/2培養基中生長速度最慢，最終生物量為（3.35 ± 0.10）g/L。由此可見，ASW培養基更適合紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）的生長。

圖1 4種不同培養基對紅孢囊藻（Rhodosorus sp.SCSIO-45730）生長的影響

2.2 不同培養基對紅孢囊藻（Rhodosorus sp.SCSIO-45730）總糖和β-葡聚糖積累的影響

對4種培養基中微藻總糖和β-葡聚糖含量進行測定，結果表明：培養至第16天，除Erdschreiber培養基外，其余3種培養基中微藻的總糖含量均在47.80% DW以上，其中，ASW培養基中微藻總糖產率顯著高于其他3種培養基，達（286.48 ± 1.67）mg/L·d（圖2-A）。β-葡聚糖含量在4種培養基中的積累情況如圖2-B所示。Erdschreiber培養基中微藻β-葡聚糖含量顯著低于其他3種培養基，f/2培養基中微藻的β-葡聚糖含量最高，可占細胞干重的（23.42 ± 0.12）%，ASW培養基中微藻β-葡聚糖含量為（21.38 ± 0.10）% DW，但其產率顯著高于其他3種培養基，達（126.94 ± 1.21）mg/L·d。綜上所述，4種培養基中，ASW培養基最有利于紅孢囊藻SCSIO-45730總糖和β-葡聚糖的積累。

圖2 4種不同培養基對紅孢囊藻（Rhodosorus sp.SCSIO-45730）總糖和β-葡聚糖積累的影響

2.3 不同鹽度對紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）生長及細胞的影響

紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）在不同鹽度ASW培養基中的生長情況，如圖3所示。該藻在低鹽（10‰）或高鹽（68‰）環境中生長被嚴重抑制，藻細胞已經凋亡甚至是裂解（圖4-A和4-G）；在其它5個鹽度條件下（18‰、28‰、38‰、48‰和58‰），其均能正常生長，但生長速度存在明顯差異。隨著鹽度從18‰增加到38‰，微藻生長速度變快，生物量顯著增加（P＜0.01）；至培養結束（第16天），38‰鹽度下微藻生物量為（13.70 ± 0.21）g/L，較18‰鹽度下的生物量（7.10 ± 0.01）g/L）增加了93.0%（P＜0.01）。隨著鹽度繼續增加至58‰，微藻生長受到抑制，生物量明顯降低，至第16天時，58‰鹽度下的微藻生物量降至（4.03 ± 0.16）g/L（P＜0.01）。此外，紅孢囊藻SCSIO-45730細胞形態也隨著鹽度的增加而變化，如圖4所示，在培養至第8天，隨著鹽度的增加，微藻細胞逐漸變大，顏色逐漸變淺，細胞呈現聚團現象。鹽度為18‰時，微藻主要呈單細胞狀態，而鹽度為48‰和58‰時細胞明顯增大（圖4-E和圖4-F）且聚集成團。

綜合不同鹽度下紅孢囊藻（Rhodosorussp.SCSIO-45730）生長及細胞形態結果，可認為該藻在18‰-58‰鹽度范圍內能正常生長且生物量高。其中，38‰鹽度最利于微藻生長，鹽度低于或高于38‰均會對微藻生長造成一定程度的抑制。

圖3 不同鹽度對紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）生長的影響

圖4 不同鹽度下紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）細胞形態（第8天）

2.4 不同鹽度對紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）總糖和β-葡聚糖積累的影響

對不同鹽度下微藻總糖進行提取和測定發現（圖5-A），在培養結束（第16天），微藻的總糖含量和產率，在18‰-38‰鹽度范圍內呈現增加趨勢，在38‰-58‰鹽度范圍內呈下降趨勢。38‰鹽度組微藻的總糖含量最高，達（48.52±0.07）% DW，其產率可達（412.58±2.88）mg/L·d，顯著高于其它鹽度組（P＜0.01）。此外，β-葡聚糖測定結果表明（圖5-B），微藻中β-葡聚糖含量和產率隨著鹽度增加呈現下降趨勢；在鹽度為18‰時，微藻中β-葡聚糖含量最高，達（22.76±0.08）% DW，而β-葡聚糖產率在鹽度為28‰和38‰時無明顯差別，分別為（120.22±1.67）mg/L·d和（119.70±0.59）mg/L·d，顯著高于其它鹽度組（P＜0.01）。

圖5 不同鹽度對紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）總糖含量和產率的影響

2.5 戶外生長及總糖和β-葡聚糖積累情況

紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）在戶外6 cm光徑平板光生物反應器中的生長情況如圖6所示，培養至第18天，微藻生物量達1.34 g/L，產率為74.44 mg/L·d，藻液顏色由暗紅色（圖6-B）變成黃褐色（圖6-C）。微藻前后顏色差異說明，微藻細胞色素及藻膽蛋白含量和組成可能發生變化。

圖6 紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）在戶外平板光生物反應器中的生長情況

總糖和β-葡聚糖測定結果表明（圖7），隨著培養時間的延長，紅孢囊藻SCSIO-45730細胞內總糖和β-葡聚糖含量呈增加趨勢，在第16天，藻細胞內總糖和β-葡聚糖顯著增加，分別占干重的（52.78± 0.27）%和（16.39 ± 0.15）%，至培養結束（第18天），藻細胞內總糖和β-葡聚糖含量分別為干重的（54.47 ± 0.33）%和（17.46 ± 0.27）%，其單位體積產量分別為0.73 g/L和0.23 g/L。

3 討論

3.1 不同培養基中紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）生長、總糖和β-葡聚糖積累情況

培養條件如培養基、鹽度、光照、溫度等對微藻的生長和生化組成有重要影響，進而會影響微藻的開發利用［16］。培養基優化實驗表明，ASW培養基最有利于紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）生物量、總糖和β-葡聚糖的積累。在該條件下，微藻生物量、總糖和β-葡聚糖產率分別為（9.50 ± 0.13）g/L、（286.48 ± 1.67）mg/L·d和（126.94 ± 1.21）mg/L·d。Li等［17］利用同樣的ASW培養基培養紫球藻（Porphyridium purpureumSCS-02），生物量為5.54 g/L，其總糖產率為133.75 mg/L·d，表明ASW培養基有利于單細胞紅藻的培養，可以選擇其為基礎培養基對紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）進行進一步培養研究。此外，紅孢囊藻SCSIO-45730較高的生物量表明其有較大的開發利用潛力。

圖7 紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）在戶外培養過程中總糖和β-葡聚糖含量的變化

3.2 不同鹽度下紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）生長、總糖和β-葡聚糖積累情況

鹽度是影響海洋微藻生長的一個重要環境因子，過低或過高都會引起微藻生長及生化組成變化。如鹽藻（Dunaliella salina）在20‰-100‰鹽度范圍內均能正常生長，其生物量在40‰鹽度時達到最高值1.19 g/L［18］；三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生長在低鹽度或者高鹽度下均受到一定程度抑制，且高鹽度對藻細胞生長的抑制作用更明顯［19］，與本研究結果一致。鹽度偏低或偏高會引起微藻細胞內某些酶，如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco，光合作用限速酶）等，以及離子轉運體（如Na+/H+轉運體等）活性的降低，從而使微藻生長受到抑制［20］。本研究中，紅孢囊藻（Rhodosorussp.SCSIO-45730）具有廣泛的鹽度適應性，可在18‰-58‰鹽度范圍內正常生長，在鹽度為38‰時可獲得最大生物量，為13.70 g/L，顯著高于同等培養條件下紫球藻（Porphyridium purpureumSCS-02）的生物量［17］。而隨著鹽度變化，微藻細胞大小的變化及聚團現象與細胞內外滲透壓的變化以及胞外多糖的分泌有關［19］。

多數研究表明，在一定范圍內適當增加鹽度可促進微藻糖類物質積累，但是不同微藻鹽度耐受性不同［16］，如在35‰鹽度下，硅藻（Chaetoceroscf.wighamii）細胞內糖含量較其在25‰鹽度下高［13］；在鹽度10‰-60‰范圍內，四爿藻（Tetraselmis suecica）糖含量呈現增加的趨勢，在鹽度為50‰時獲最大含量，為53.0% DW［21］。本研究中，紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）細胞內總糖含量和產率在38‰鹽度時達到最大值，而在鹽度低于或高于38‰時均呈現不同程度的降低。據報道，微藻在高鹽條件下能積累小分子糖類以調節細胞內外滲透壓，從而降低細胞損傷及死亡，使微藻適應高鹽環境［19］。隨著鹽度進一步增加，細胞內積累的糖類物質不足以平衡細胞內外滲透壓，為維持正常生長，微藻會消耗積累的糖類物質為細胞生長提供能量，從而導致細胞中糖含量的降低［20］。

隨著全球能源需求和消耗增加，以及化石燃料帶來的一系列環境問題，人們越來越重視生物質能源的開發。其中，生物乙醇由于辛烷值和蒸發熱較傳統化石燃料高、燃燒完全、無污染等特點而備受關注［22］。微藻具有生長快、種類多，固碳效率高，不占用農用耕地等特點，被認為是生產第3代生物乙醇的理想原料［23］。微藻中糖類物質由于不含木質纖維素，因而無需進行前處理便可輕易轉化成可發酵糖用于生物乙醇生產。在氮饑餓條件下，小球藻（C. vulgarisFSP-E）能積累51% DW的糖類物質，每克底物可生產生物乙醇0.23 g［24］。Chen等報道［25］四爿藻（Tetraselmissp. CS-362）、紫菜（Porphyra）、斜生柵藻（S. ObliquusCNW-N）、綠球藻（Chlorococumsp.）和萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtiiUTEX90）等，含糖量為26%-60%，可用于生產生物乙醇。本研究中，紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）在鹽度為38‰時具有較高的生物量、總糖含量及產率，表明其是生產生物乙醇的潛在原料。

β-葡聚糖具有較高的營養價值和重要的生物功能，目前已被許多國家如中國、美國、日本及澳大利亞等國批準作為免疫調節劑和食品添加劑等功能性成分，應用于醫藥、食品和化妝品等行業［9］。據報道，微藻β-葡聚糖主要以β-1，3-鍵連接，具有低分子量和高支化度，因而可以產生比市售酵母β-葡聚糖更好的免疫反應［26-27］。因此，對微藻β-葡聚糖進行開發研究具有較大的開發應用潛力。牟氏角毛藻（Chaetoceros mulleri）中β-葡聚單位體積產量為71.57 mg/L，微擬球藻（NannochloropsisNpUNAM）中β-葡聚單位體積產量為81.55 mg/L，它們是生產β-葡聚的重要來源［7，28］。紅孢囊藻（Rhodosorussp.SCSIO-45730）β-葡聚糖產率在38‰鹽度時達最大值119.70 mg/L·d，單位體積產量為1.92 g/L，因此，可作為生產β-葡聚糖的潛在來源。該藻細胞中β-葡聚糖含量隨著鹽度增加而降低，這一機理尚不明確，有待進一步研究。Jia等［29］報道在氮充足條件下，β-葡聚糖可與三酰甘油競爭碳源，成為微擬球藻（Nannochloropsis oceanica）細胞內主要臨時碳儲存形式，在氮耗盡后，β-葡聚糖代謝調節將有利于促進三酰甘油的合成。另有研究表明，鹽度對紫球藻氮利用有一定影響［20］，紫球藻細胞對NaNO3的消耗能力隨著鹽度增加而呈梯度性增加。因此，我們推測，高鹽度下紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）對NaNO3的消耗增加，導致培養基中NaNO3濃度降低，從而引起藻細胞內β-葡聚糖含量降低。

3.3 戶外試驗下紅孢囊藻（Rhodosorus sp. SCSIO-45730）生長、總糖和β-葡聚糖積累情況

紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）戶外初步培養實驗研究表明，微藻可以在戶外正常生長，在6 cm光徑平板光生物反應器中，其生物量可達到1.34 g/L，細胞內總糖和β-葡聚糖單位體積產量分別為0.73 g/L和0.23 g/L，而單位體積產量是確定微藻生產潛力的重要指標［7］。Onay［30］報道了微藻（HindakiatetrachotomaME03）在不含市政污水的平板光生物反應器獲得最大生物量0.89 g/L，而其在含50%市政污水的平板光生物反應器中碳水化合物體積產量最高，為0.17 g/L，是生產生物乙醇的潛在候選物種。Rojo-Cebreros等［7］研究表明，微擬球藻（NannochloropsisNpUNAM）可產生81.55 mg/L β-葡聚糖，且具有在平板光生物反應器中生產高產量β-葡聚糖的潛能，可作為β-葡聚糖的潛在來源。在戶外培養初步實驗中，紅孢囊藻（Rhodosorussp.SCSIO-45730）可獲得較高的總糖和β-葡聚糖產量，表明其具有規模培養，特別是開放系統培養以生產生物乙醇和β-葡聚糖的潛力，但還需要進一步對微藻戶外培養性能進行長期更詳盡及系統的研究。

4 結論

紅 孢 囊 藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）在ASW培養基中生長速度快，總糖和β-葡聚糖含量高，且具有較廣泛的鹽度適應性，可在18‰-58‰鹽度范圍內正常生長，當鹽度為38‰時，可獲得較高產率的生物質、總糖及β-葡聚糖；該藻可利用戶外平板光生物反應器進行培養，紅孢囊藻（Rhodosorussp. SCSIO-45730）具有規?；a生物乙醇和β-葡聚糖的潛力。