基于生物酶解法的牛乳蛋白脫敏技術研究進展

張 琦，何國慶

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310085)

食物過敏是一個備受各國政府及公眾關注的健康問題，而牛乳是聯合國糧農組織(FAO)認定的八大類主要過敏食物之一［1］。牛乳蛋白過敏(cow’s milk protein allergy，CMPA)可引發過敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等癥狀［2］。這種過敏反應會威脅嬰幼兒健康，甚至導致其死亡。據調查顯示，對牛乳過敏的學齡前兒童占0.6%～2.5%，5～16歲人群占0.3%，成年人小于0.5%［3］。

目前，降低牛奶致敏性的方法主要可以分為物理法、化學法、生物酶法等。物理法主要通過去折疊、聚合、交聯等方式來改變蛋白質的高級結構，但并不改變其一級結構［4］，可以在使蛋白質改性的同時又能維持乳蛋白原有的感官品質和營養成分。生物酶法是目前應用較為廣泛的一種水解方式，其操作較為簡單，安全性高，并且可以與物理方法相結合來增強水解效果［5］。

針對牛乳蛋白改性，酶解法一直是研究的重點。利用蛋白酶的內切和外切作用，使蛋白質降解為肽類產物和較小氨基酸分子，酶解技術按照酶解程度和酶解后產物分子量大小及分布情況可分為輕度酶解(Slight hydrolysis)、適度酶解(Moderate hydrolysis)和深度酶解(Extensive hydrolysis)。其中，輕度酶解和適度酶解通常被劃歸為限制性酶解，因其可實現水解度和產物多樣性控制而多應用于生產功能性蛋白和活性肽。深度酶解則多用于得到低抗原性酶解產物，因其產物主要是短肽和單體氨基酸，并且90%的肽分子量都低于500 Da，經常應用于營養配方。同時，酶解分為單酶水解和復合酶水解，采用復合酶水解時根據不同酶的添加順序又可以分為同步酶解和分步酶解［6］。

目前，雖然酶解技術逐漸完善，但體系方法相對單一，如果想將酶水解工業化應用，那么水解位點的準確控制、水解產物組成及分子量分布以及對于水解產物的標準化應用等，都是亟待解決的問題。如果可以將其與當前發現的抗原表位信息和酶的作用位點信息相結合，以進行針對性地破壞，得到理想的目標產物，對于低敏乳品的開發將具有重大意義。

本文主要對牛乳過敏蛋白致敏表位、幾種生物酶水解技術及其作用效果和引起抗原性降低的可能機制進行綜述，希望可以為低致敏乳制品研究和定向水解提供依據。

1 牛乳主要過敏原及其抗原表位

在牛乳中含有的30多種蛋白質中，主要的過敏原是酪蛋白(CN)、β－乳球蛋白(β－LG)及α－乳白蛋白(α－LA)，牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IDS)及乳鐵蛋白(LF)被認為是次要過敏原［7］。

1.1 酪蛋白

酪蛋白占乳蛋白總量的78%～80%，包括四種類型:αs1－(40%)、αs2－(10%)、β－(35%)和κ－(12.5%)，四種酪蛋白通常聚合成懸浮在乳清中的微粒，它們都是磷酸化的蛋白質，其三級結構容易發生變化［1］。αs1－酪蛋白是由199個氨基酸殘基組成的線性單鏈磷酸化蛋白，分子量為23 k Da，是酪蛋白中最主要的過敏原。每個分子中結合有8個磷酸根，大部分分布在45～89位，不含二硫鍵。其中，αs2－酪蛋白親水性最強、分子量最大，在25 kDa左右。β－酪蛋白的性質最為穩定，疏水性和抗原特異性最強［8］。κ－酪蛋白結構性最高，對鈣離子不敏感，是唯一含糖的酪蛋白。

線性表位(特定的氨基酸序列肽段)研究表明酪蛋白約包含60個IgE結合位點，αs1－、αs2－、β－和κ－酪蛋白分別占據20、17、13和10個［9］。對αs1－酪蛋白的研究中，已經得到了與T細胞結合的表位aa43～66，aa73～96，aa91～114，aa127～180［10］;IgG結合表位aa21～35，aa56～70，aa161～175，IgE結合表位aa6～20，aa11～25，aa126～140，aa171～185［11］;對αs1－酪蛋白進行生物信息學分析發現αs1－酪蛋白的1～16位是信號肽，無跨膜區，有3個糖基化位點、5個酪蛋白激酶磷酸化位點、3個蛋白激酶C磷酸化位點，通過IEDB數據庫預測了αs1－酪蛋白的抗原區為aa16～29，aa45～50，aa52～54，aa56～70，aa74～75，aa77～86，aa94～104，aa142～152，aa173～179，aa185～210［12］。在αs2－酪蛋白表位研究中，發現了主要IgE結合表位aa83～100，aa143～158，aa157～172，aa165～188。另外，aa31～44，aa43～56，aa93～106，aa105～114，aa117～128，aa191～200是它的六個次要過敏表位［13］。

IgE結合表位aa1～16，aa83～92，aa135～144和IgG結合表位aa1～14，aa23～34，aa55～68，aa79～92，aa107～120，aa135～144，aa149～160，aa183～208，主要可以被B細胞結合，其中aa83～92和aa135～144是二者共有的表位［14］。在構象性表位的研究中，劉法輝［15］定位出β－酪蛋白的4個構象性表位;κ－酪蛋白的3個主要IgE表位:aa9～26，aa21～44，aa47～68可以被93%的患者血清結合，2個主要IgG表位為aa55～80和aa105～116。

1.2 β－乳球蛋白

β－乳球蛋白占牛奶乳清蛋白總量的50%以上，是公認的牛奶中最主要的過敏原之一，它含有162個氨基酸殘基，分子量為18.3 kDa左右，等電點為5.3，有2個遺傳變異體，由4個鏈內二硫鍵和1個鏈間二硫鍵連接組成，呈水溶性［16］。其能抵抗胃酸和胃蛋白酶的作用，進入血液循環從而引發過敏反應［15］。有文獻統計，牛乳過敏人群中的82%是對β－乳球蛋白過敏［17］。

牛乳β－乳球蛋白中最主要的致敏表位為aa41～60，aa102～124，aa149～162，90%以上的牛乳過敏患者的T細胞都可以識別這三個表位［18］。目前隨著對β－乳球蛋白的關注越來越深入，對其過敏表位的探究也日漸增多。通過酶法切割抗原定位出了IgE結合表位，最主要的有肽段aa102～124，aa41～60，aa149～162;主要過敏原表位有aa1～8，aa25～40;次要過敏原表位aa9～14，aa84～91，aa92～100［19］。利用病人血清通過肽掃描技術，定位出了牛乳β－乳球蛋白的IgE結合表位aa1～16，aa31～48，aa47～60，aa67～78，aa75～86，aa127～144，aa141～152，aa17～31，aa72～86，aa92～106，aa152～166和IgG結合表位aa1～16，aa51～64，aa67～78，aa85～96，aa129～144，aa139～156，aa22～36，aa127～141［20－21］。后期又通過肽掃描定位的方法找到了兩個新的表位aa134～143，aa150～159［22］。在構象性表位(肽鏈折疊后一些特定氨基酸基團構成的特定空間構型)的研究中，發現了3個牛乳β－乳球蛋白表位L87～N88～N90～K91～E108～S110，I2～T4～P113～Q115～P144，T18～Y20～E44～E45～K47～E55～E157［23］。

1.3 α－乳白蛋白

α－乳白蛋白由123個氨基酸殘基構成，其分子量為14.2 k Da，蛋白結構中有四個二硫鍵，并且對鈣具有高親和性。這保證了其二級結構和天然構象的穩定性［4］。α－乳白蛋白占乳清蛋白的25%，與人乳中的α－乳白蛋白同源性為74%，另有6%的氨基酸殘基化學性質相似［24］。在線性表位方面，4個IgE表位aa1～16，aa13～26，aa47～58，aa93～102和3個IgG結合表位aa7～18，aa51～61，aa89～108，其中aa7～18，aa51～58為共識結合表位［21］。在對于α－乳白蛋白T細胞表位的研究中，發現了4個表位:aa19～36，aa25～42，aa31～48，aa43～60［25］。Adams等［26］在合成肽aa5－18中發現了α－乳白蛋白的IgE線性結合表位。叢艷君等［27］通過固相合成技術，合成α－乳白蛋白系列多肽并以牛乳過敏患者血清為探針，通過酶聯免疫吸附分析法識別到α－乳白蛋白的5個IgE作用表位aa1～15，aa6～20，aa46～60，aa71～85，aa101～115;其中V8，F9，R10，Y103，L105，H107為影響α－乳白蛋白致敏性的關鍵氨基酸;并以相同方法定位α－乳白蛋白的IgG作用表位的氨基酸序列為aa6～20，aa21～35、aa36～50和aa86～100;關鍵氨基酸為F9、L15、P24、W26和H32。

2 生物酶解法水解牛乳蛋白技術

蛋白酶可以水解蛋白質肽鏈，破壞過敏蛋白的結構，從而顯著降低蛋白質的過敏性。對于牛乳蛋白來說，蛋白酶可以將其水解為小分子乳蛋白、乳蛋白肽甚至是氨基酸，能夠降低它的致敏性［28］。目前比較成熟的商品化酶主要有包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶在內的多種蛋白酶。不同的酶對應的酶切位點不同，如中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶沒有特異性作用位點，胰蛋白酶主要水解Lys－或Arg－殘基，胃蛋白酶水解芳香族氨基酸的N端或者C端，堿性蛋白酶作用于疏水性氨基酸的C端，木瓜蛋白酶內切Arg－、Lys－和Phe－殘基等［29］。

早期對于酶解法的研究主要集中在用一種蛋白酶單獨進行水解，后來發展為用兩種以上的酶進行復合水解，起到彼此補充的作用。目前工業上生產配方乳粉大多采用成熟的熱加工輔助酶解法。但是，在應用過程中，熱加工輔助酶解法會影響乳產品的營養和感官品質。因此，用其他物理處理方法輔助酶解近年來也備受關注。

2.1 單酶水解牛乳蛋白

直接單酶法的研究重點是根據不同過敏原蛋白的性質而選擇相應的蛋白酶。研究結果表明直接單酶法具有較為顯著的效果。

αs1－酪蛋白分別被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解，其中胰蛋白酶水解后，蛋白質的抗原性降低了85%，而胰凝乳蛋白酶在pH7.8時降低了63%。p H2.2時抗原性降低60%［30］。選用7種不同的生物酶水解酪蛋白［31］，中性蛋白酶水解效果最好，并且水解產物的抗原性顯著降低。用5種酶水解酪蛋白的結果表明，堿性蛋白酶在降低酪蛋白抗原性方面效果最好，因為堿性氨基酸的裂解位點包含疏水氨基酸的羧基末端而酪蛋白中的疏水氨基酸含量比較高，因此酪蛋白可以水解得更加完全以獲得所需的效果;但是木瓜蛋白酶不僅可以降低酪蛋白的抗原性，而且可以獲得更好的酶解產物風味，從而得出木瓜蛋白酶更適合水解酪蛋白的結論［32］。汝成業等［33］篩選得到一株優先降解αs1－酪蛋白的產堿性蛋白酶菌株，但其游離酶穩定性較差，故采用海藻酸鈉包埋法對純化獲得的堿性蛋白酶進行固定化，對αs1－酪蛋白作用的特異性較強，不影響乳制品的使用，同時可以提高回收率，實現多次使用。在乳清蛋白方面，有研究表明［34］，用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別酶解100℃加熱處理后的乳清蛋白，酶解產物的抗原性均顯著降低。這是由于乳清蛋白包含相應的酶切位點。在酶解對乳清蛋白的抗原性影響研究中［35］，用7種生物酶分別水解乳清蛋白，堿性蛋白酶的效果最佳，主要原因是堿性蛋白酶的酶切位點中包含疏水性氨基酸的羧基，可以較大程度地使蛋白質分子內部的肽鍵斷裂，從而達到破壞抗原表位的目的。

2.2 多酶復合水解牛乳蛋白

選用微生物內肽酶加外肽酶酶解乳清，水解產物經分子和細胞檢測，酶解產物對肥大細胞脫顆粒的抑制作用較為明顯，而對T細胞的刺激響應較慢［36］。Wroblewask等［37］分別嘗試了單獨使用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及二者混合使用，分別在水解開始時和水解1.5 h后再加入，水解相同時間，最終結果表明兩種酶兩步水解的效果最佳。在先用胰蛋白酶、風味蛋白酶單獨水解，再用兩種酶進行分步水解牛乳蛋白的實驗中，三種方法均降低了α－乳白蛋白、β－乳球蛋白、酪蛋白，并且其中兩種酶分步水解法對抗原性的降低程度最顯著，得到的水解產物中小分子量(小于5 kDa)的肽段含量更高，產物中的苦味肽含量也最少［38］。有實驗以牛乳β－酪蛋白為原料對其進行體外模擬消化，探討胃腸消化條件下，胃蛋白酶、胰蛋白酶和復合酶連續消化產物的結構與功能特性，結果表明，復合酶消化產物水解度最大［39］。與單酶水解相比較，復合酶水解效果更好［40］，是因為不同酶的酶切位點可以互相補充，作用更多的致敏表位，實現多次切割，使蛋白質水解得更加完全，斷裂成更小的肽段其包含完整抗原的可能性也更小［41］。

2.3 物理法－酶解法偶聯技術

在酶解前或者酶解過程中與其他的物理方法偶聯，是現在研究較多的一個方向。Ambrosi等［42］在不同的壓力條件下用α－胰凝乳的蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解乳清蛋白，發現水解程度在一定范圍內隨著壓力和時間的增加而增大，并且暴露出更多的抗原表位。壓力的影響主要與蛋白質的去折疊有關，使其在天然結構中不易被接觸到的酶作用區域暴露。高壓導致完整的蛋白快速分解，使中等大小的肽段積累，然后再進一步被水解為更小的片段［43］。用BALB/c小鼠作為模型用于評估高壓處理下用胃蛋白酶酶解得到的乳清蛋白水解產物的誘導過敏反應的能力，部分證實了高壓水解產物的低致敏性［44－45］，另外，隨著高壓的壓強、加壓時間以及溫度的變化，水解產物的抗原性也會受到影響，出現先上升后下降的情況［46］。通過微波輔助胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和混合酶分別水解乳清蛋白，發現微波輔助對降低乳清蛋白的抗原性具有顯著作用［47］。在探究超聲波預處理對菠蘿蛋白酶水解乳清蛋白的影響的實驗中，超聲處理提高了蛋白質對菠蘿蛋白酶的敏感性，顯著提高了水解速率以及生物活性物質的轉化速率，并且通過差示掃描量熱法(DSC)觀察到了超聲處理引起蛋白質的變性和聚集［48］。超聲同樣可以使酪蛋白在低分子量區域的組分比例明顯增加［49］，通過改變其結構特征而使抗原性降低。

通過單酶水解、復合酶水解和物理法輔助酶解技術得到的水解產物其抗原性顯著降低，說明這些方法效果優良，并且不同方法的有機結合有效減少了對產物原有品質的影響。但是在實際應用中，具體酶的選用和處理方式對于產物的風味的影響還需進一步考慮。

3 生物酶法水解過敏原的機制

能夠致敏的蛋白一般對胃腸道的消化功能有著較強的抵抗力，因此在體外預先對蛋白進行酶解是消除部分免疫原性的有效方法之一。酶的種類和水解能力直接影響蛋白質構象表位的破壞和線性表位的斷裂，是完整的抗原表位能否存在的決定性因素［50］。比較常用的蛋白酶有植物源的菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶;動物源的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶;微生物源的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。

用蛋白酶對乳蛋白進行限制性切割使致敏蛋白的肽鍵斷裂成小分子肽段，能夠達到降低其分子量的目的(破壞線性表位)，或者通過影響蛋白質的三級結構，去除蛋白質表面和空間中的的一些構象抗原表位，使其無法被識別，來降低抗原性［51］。在利用乳酸菌產酶水解乳清蛋白的研究中，隨著蛋白酶的不斷產生與積累，主要致敏蛋白的抗原性先降低，再上升，再降低，這是由于在經蛋白酶初步水解形成大肽后，一些隱形表位或線性表位被暴露出來，而隨著時間延長，這些表位又逐漸被降解，從而造成了最終抗原性的降低［52］。在用胃蛋白酶、胰蛋白酶及復合酶水解牛乳蛋白的研究中，紅外光譜和SDS電泳結果表明，酶解后，蛋白分子量由24 kDa降低到17、10 k Da等小分子量肽，二級結構破壞，α－螺旋含量下降，β－折疊含量下降，表面疏水性降低［35］。有研究利用一種絲氨酸蛋白酶對牛乳蛋白進行水解，發現乳清蛋白與酪蛋白隨著水解度的增加，疏水性降低，同時抗原性也隨之降低［53－54］。

目前，利用生物酶水解蛋白的工藝都具有一定的隨機性，造成了水解產物的不穩定性。將過敏原蛋白的線性表位和構象性表位信息合理地與不同生物酶的特異性酶切位點進行搭配，針對性地破壞抗原表位，定向得到理想的低抗原性酶解產物，可以作為獲得低致敏性乳蛋白的重要途徑。

4 展望

目前，通過研究確定的牛乳蛋白中的抗原表位越來越豐富，抗原酶解技術日趨完善，配方奶粉的種類也越來越多。然而只利用蛋白酶進行水解，得到的水解產物具有很強的隨機性，不能保證產物的組成。在未來的研究中，將已有的過敏原表位信息和生物酶的酶切位點特異性相結合，可能是比較高效的、得到低抗原性水解產物的方法。若再偶聯合適的物理方法，則對致敏蛋白的水解效果可能更為有效，在此基礎上，也可以嘗試將化學等方法與酶解過程相結合，如此可以進一步完善脫敏技術，提高生產效率，為未來的低敏性奶粉的生產提供新的方向。