自體軟骨細胞移植技術治療膝關節(jié)軟骨缺損 11 例報告

王志學 姬振偉 徐奎 吳鵬 程世陽 丁勇

各種原因導致的膝關節(jié)軟骨損傷發(fā)生率為5%，在特定人群中如運動員的發(fā)生率可高達 22%～50%[1]。人體膝關節(jié)軟骨無血管組織、無血液供應，營養(yǎng)主要來源于關節(jié)腔內滑液，一旦損傷就很難再生，后期可能發(fā)展為骨關節(jié)炎[2]。因此膝關節(jié)軟骨修復成為骨科醫(yī)生最具挑戰(zhàn)性的臨床難題之一。膝關節(jié)軟骨缺損的傳統(tǒng)治療方法包括關節(jié)鏡下清理術、微骨折術、自體骨軟骨移植術 ( 馬賽克技術 )，但是這些方法各有其不足之處。關節(jié)鏡下清理術只能暫時緩解臨床癥狀，不能促進缺損區(qū)軟骨修復。而微骨折術后再生的組織為纖維軟骨，其耐磨性、生物力學性能和透明軟骨相差很遠，達不到真正意義上的軟骨修復[3]。自體骨軟骨移植術則存在供體受限、不適合大面積軟骨缺損等問題，而且骨軟骨栓之間的間隙可導致軟骨退變[4-5]。隨著醫(yī)學技術的進步和組織工程的興起，自體軟骨細胞移植技術 ( autologous chondrocyte implantation，ACI ) 開始應用于臨床。本研究應用 ACI 治療創(chuàng)傷和剝脫性骨軟骨炎導致的膝關節(jié)軟骨缺損，采用 Lysholm評分、國際膝關節(jié)文獻委員會 ( International Knee Documentation Committee，IKDC ) 主觀評分和 MRI 對11 例進行術后最長 7 年隨訪。報告如下。

資料與方法

一、納入標準與排除標準

1. 納入標準：( 1 ) 年齡 18～55 歲；( 2 ) 膝關節(jié)急性或繼發(fā)性軟骨缺損患者；( 3 ) 缺損面積 2.5～8.0 cm2；( 4 ) 缺損程度 Outerbridge Ⅲ / Ⅳ 級。

2. 排除標準：( 1 ) 感染性關節(jié)病；( 2 ) 關節(jié)強直；( 3 ) 痛風；( 4 ) 傳染性疾病 ( 肝炎、HIV、梅毒等 )；( 5 ) 糖尿病；( 6 ) 體質量指數(shù) ( body mass index，BMI ) ≥ 30；( 7 ) 妊娠期患者；( 8 ) 下肢力線異常 ( 內翻或外翻超過正常值 5° )；( 9 ) 精神異常；( 10 ) 醫(yī)生判定不能手術的其它情況患者。

二、一般資料

本研究納入 2012 年 6 月至 2014 年 6 月于我科住院的 11 例膝關節(jié)軟骨缺損患者，其中男 4 例( 36.36% )，女 7 例 ( 63.64% )，男女性別比為 0.57∶1；年齡 19～42 歲，平均年齡 ( 26.91±6.92 ) 歲。根據(jù) Outerbridge 標準分級[6]，軟骨缺損為 Ⅲ～Ⅳ 級，缺損面積 2.0～4.2 cm2，平均 ( 3.12±0.70 ) cm2，其中股骨外髁 6 處，股骨內髁 3 處，髕骨 2 處。3 例伴有初次髕骨脫位，3 例伴有半月板撕裂，1 例伴有色素沉著絨毛結節(jié)性滑膜炎。隨訪時間 5.3～7.5 年，平均 ( 6.46±0.79 ) 年。所有受試者均簽署知情同意書，臨床研究按照赫爾辛基宣言和中國倫理委員會要求進行。

三、手術方法

1. 術前準備：常規(guī)進行患膝關節(jié)正側位 X 線片和 3.0 T MRI 檢查，檢測下肢力線和 Q 角，結合臨床查體。如發(fā)現(xiàn)伴有髕骨脫位，半月板損傷，滑膜炎等合并癥，則同時進行相應手術治療。排除手術禁忌，術前進行 Lysholm 評分和 IKDC 評分。

2. 關節(jié)鏡探查術：硬膜外麻醉下手術。氣壓止血帶充氣至 50～60 kPa。取膝關節(jié)前內、前外入路，鏡下檢查膝關節(jié)滑膜、內外側半月板、前后交叉韌帶以及髕股關節(jié)對應關系，如有損傷或病變進行相應處理 ( 3 例伴有初次髕骨脫位進行髕骨外側支持帶松解術，3 例伴有半月板撕裂進行半月板部分切除成形術，1 例伴有色素沉著絨毛結節(jié)性滑膜炎進行滑膜切除術 )。鏡下探查明確膝關節(jié)軟骨缺損具體部位和范圍 ( 圖 1 )。取關節(jié)非負重區(qū)健康軟骨200～300 mg 作為種子細胞，送實驗室 ( 陜西瑞盛生物科技有限公司 ) 進行自體軟骨細胞制備。沖洗關節(jié)腔，縫合切口，手術完畢。

3. 移植物制備：超凈工作臺內使用磷酸緩沖鹽溶液 ( phosphate buffer saline，PBS ) 反復清洗軟骨碎片，Ⅱ 型膠原酶消化約 15～20 h。終止消化后依次進行離心、棄上清，并接種于培養(yǎng)皿置于恒溫箱培養(yǎng)。定期觀察軟骨細胞生長、換液及傳代。培養(yǎng)后約 6～8 周完成細胞計數(shù)和安全性檢測，從培養(yǎng)皿底部機械分離軟骨細胞移植物，制備完成。同時預約患者再次入院，準備手術移植。

4. 手術移植：硬膜外麻醉下常規(guī)消毒鋪巾。再次關節(jié)鏡探查軟骨缺損區(qū)，撤關節(jié)鏡后根據(jù)膝關節(jié)軟骨缺損具體部位采用不同關節(jié)入路切開暴露關節(jié)缺損。同時將自體軟骨細胞移植物浸入 0.9% 氯化鈉溶液中備用 ( 圖 2 )。缺損區(qū)清創(chuàng)至軟骨下骨，修整缺損邊緣。修剪自體軟骨細胞膜片以匹配缺損形狀，均勻覆蓋于缺損區(qū)之后使用重組人纖維蛋白凝膠固定 ( 圖 3 )。靜置約 3 min，屈伸關節(jié)確定膜片無松動脫落。輕柔沖洗，依次縫合關閉切口。

5. 術后康復：術后佩戴可調節(jié)膝關節(jié)支具逐步進行功能康復鍛煉。術后 48 h 內固定于伸膝位，術后 48 h 進行 0°～30° 之間主動屈伸膝活動，配合持續(xù)關節(jié)被動鍛煉 ( CPM 機 )，同時進行股四頭肌肌力恢復鍛煉。逐步加大屈伸角度，術后 4～6 周開始部分負重活動，術后 12 周可去除支具。術后 1 年內避免對抗性體育活動。

四、評價指標

1. 術后 Lysholm 評分和 IKDC 評分：術前常規(guī)進行患側膝關節(jié) Lysholm 評分和 IKDC 評分。Lysholm評分分別于術后 3 個月、術后 2 年和末次隨訪時進行。從跛行、負重、交鎖、關節(jié)不穩(wěn)、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲共 8 個方面對膝關節(jié)功能進行評估[7]。IKDC 評分同樣于術后 3 個月、術后 2 年和末次隨訪時進行，通過調查問卷的形式調查患者的主觀癥狀變化[8]。

圖 1 患者，女，28 歲，關節(jié)鏡下探查見股骨外髁軟骨缺損伴有色素沉著絨毛結節(jié)性滑膜炎Fig.1 A 28-year-old female with femur lateral condyle cartilage defect and pigmented villonodular synovitis

圖 2 自體軟骨細胞移植物浸入 0.9% 氯化鈉溶液中備用Fig.2 Autologous chondrocyte grafts were immersed in 0.9% sodium chloride solution for preparation

2. 術后 MRI 檢查：術后 3 個月、術后 2 年和末次隨訪時分別進行患膝關節(jié) MRI 檢查，11 例均于空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院磁共振室完成 ( GE 公司，3.0 T )，之后交由磁共振室富有經(jīng)驗的醫(yī)師進行術前術后不同時期的影像對比，進行軟骨修復組織的磁共振觀察 ( magnetic resonance observation of cartilage repair tissue，MOCART ) 評分，分別從缺損填充程度、移植物整合情況、修復區(qū)表面連續(xù)性、修復組織的內部結構、修復組織的信號、軟骨下骨板情況、軟骨下骨情況、關節(jié)是否粘連、關節(jié)積液或滑膜炎等方面進行系統(tǒng)評估[9]。

五、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。對受試者基本資料和基線情況進行統(tǒng)計描述，計數(shù)資料用構成比表示，計量資料用表示。采用重復測量設計的方差分析，分別利用 Lysholm 評分、IKDC 評分和 MOCART 評分評價手術療效。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

所有患者均切口愈合良好，1 例合并色素沉著絨毛結節(jié)性滑膜炎術后康復依從性差，膝關節(jié)活動度恢復情況較康復計劃滯后，術后 1 個月時經(jīng)手法松解后逐漸恢復正常康復進度。所有患者未出現(xiàn)其它相關并發(fā)癥和不良事件。所有患者均獲得隨訪。

一、Lysholm 評分

采用 Lysholm 評分評價 ACI 對膝關節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結果顯示，不同隨訪時間患者的 Lysholm 評分差異有統(tǒng)計學意義 (F= 89.874，P=0.000 ) ( 表 1 )。

圖 3 a：軟骨缺損區(qū)顯露；b：缺損區(qū)清創(chuàng)；c：自體軟骨細胞移植物覆蓋Fig.3 a: Exposure of the cartilage defect; b: Debridement of the cartilage defect; c: Autologous chondrocyte graft implant

二、IKDC 評分

采用 IKDC 評分評價 ACI 對膝關節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結果顯示，不同隨訪時間患者的 IKDC 評分差異有統(tǒng)計學意義 (F= 186.353，P=0.000 ) ( 表 2 )。

表 1 11 例膝關節(jié)軟骨缺損患者 Lysholm 評分 ( 分 )Tab.1 Lysholm scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

表 2 11 例膝關節(jié)軟骨缺損患者 IKDC 評分 ( 分 )Tab.2 IKDC scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

三、MRI 檢查

患者術后 3 個月 MRI 檢查顯示：軟骨缺損處基本填充，偶見局部混雜信號影，部分病例可見骨髓下水腫信號影，可見少量關節(jié)腔積液；術后 2 年軟骨組織修復信號與周圍正常組織接近，信號呈均勻一致樣改變，骨髓水腫信號較前明顯減退 ( 圖 4 )；末次隨訪顯示移植軟骨與周圍正常組織完全融合，骨髓下水腫信號影完全消失，關節(jié)面平整，無關節(jié)積液，與正常組織結構無差異 ( 圖 5 )。

四、MOCART 評分

采用 MOCART 評分評價 ACI 對膝關節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結果顯示，不同隨訪時間患者的MOCART 的評分差異有統(tǒng)計學意義 (F= 277.692，P= 0.000 ) ( 表 3 )。

表 3 11 例膝關節(jié)軟骨缺損患者 MOCART 檢查評分 ( 分 )Tab.3 Mocart scores of 11 patients with knee cartilage defect ( point )

圖 4 a：術前，白色箭頭顯示股骨外髁軟骨缺損；b：術后 2 年，白色箭頭顯示缺損區(qū)修復良好Fig.4 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: Good repair of the cartilage defect 2 years postoperation ( white arrow )

討 論

圖 5 a：術前，白色線頭顯示股骨外髁軟骨缺損；b：術后 3 個月，白色箭頭顯示原缺損區(qū)初步填充，但仍可見輕微凹陷，信號不均勻；c：術后 7 年，白色箭頭顯示原缺損區(qū)修復良好，與正常結構無差別Fig.5 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: The defect was initially filled 3 months postoperation, but with slight sunken and uneven signals ( white arrow ); c: Good repair of the cartilage defect 7 years postoperation ( white arrow )

1987 年，瑞典醫(yī)生 Peterson 最早應用 ACI 治療膝關節(jié)軟骨缺損。1994 年，Brittberg 等[10]報道使用 ACI治療 23 例膝關節(jié)軟骨缺損患者，缺損面積 1.6～6.5 cm2。術后隨訪16～66 個月 ( 平均 39 個月 )，所有患者的臨床癥狀包括關節(jié)疼痛、腫脹、關節(jié)彈響均得到改善。當時該技術需取自體脛骨近端骨膜覆蓋固定于關節(jié)表面缺損區(qū)，將含有自體軟骨細胞的混懸液注入骨膜與缺損區(qū)的間隙，通過軟骨細胞生長來修復軟骨缺損。被稱為第一代 ACI。隨著應用日漸增多，第一代 ACI 顯露出了很多缺點：細胞混懸液的滲漏、移植前軟骨細胞去分化、軟骨細胞在缺損區(qū)的不均勻分布等[11]。針對第一代 ACI 的不足，第二代 ACI 摒棄了常常導致脛前區(qū)疼痛及需要額外切口等術后并發(fā)癥的自體脛骨骨膜，而采用 Ⅰ / Ⅲ 型雙層膠原膜覆蓋膝關節(jié)缺損區(qū)并注入軟骨細胞混懸液。在一項對比研究中，第二代 ACI 術后效果明顯優(yōu)于第一代 ACI[12]。第三代 ACI 以生物材料作為軟骨種子細胞載體，而不再需要骨膜或者 Ⅰ / Ⅲ 型雙層膠原膜，也稱為基質誘導的自體軟骨細胞移植( matrixinduced autologous chondrocyte implantation，MACI )。一些研究報道了應用 MACI 技術治療膝關節(jié)軟骨缺損并獲得了滿意的臨床效果[13-16]。

由于 MACI 技術通常選擇藻酸鹽或者透明質酸等作為支架進行軟骨細胞嵌入[17]，技術要求高，治療花費較大，所以限制了該技術在臨床的進一步廣泛應用，這也是 ACI 治療膝關節(jié)軟骨缺損術后長期效果報道相對較少的原因之一。本研究采用的自體軟骨細胞膜片移植物不需要額外的生物材料作為支架，不含生物因子。相對于其它生物移植材料，可更大程度保證軟骨細胞數(shù)目和活性。本研究納入11 例膝關節(jié)軟骨缺損患者采用 ACI 治療并獲得最長7 年隨訪，通過關節(jié)功能評分的提升和 MRI 表現(xiàn)證實了該技術臨床效果滿意。Brix 等[18]報道了 53 例接受 MACI 治療的患者術后至少 5 年時間隨訪，結果顯示效果良好；Filardo 等[19]對 131 例進行最短7 年時間隨訪，關節(jié)功能改善明顯。上述研究中報道的 ACI 術后關節(jié)功能逐步改善和提升與本研究采用的軟骨細胞膜片作為移植物術后結果基本一致，這一結果說明采用無生物支架材料的自體軟骨細胞移植物修復膝關節(jié)軟骨缺損后同樣可以達到滿意的臨床效果，而且可避免生物材料降解和制備費用高昂等相應問題，這為膝關節(jié)軟骨缺損的移植材料提供了新的選擇。

本研究采用的 Lysholm 評分是國際公認的膝關節(jié)功能評分，更傾向于膝關節(jié)運動損傷的功能評估，與關節(jié)退變等因素基本無關，相對更適合本次臨床試驗的所有患者。Lysholm 評分從跛行、負重、交鎖、關節(jié)不穩(wěn)、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲共8 個方面評分總和對膝關節(jié)功能進行評估，總分為100 分。本次試驗所得數(shù)據(jù)顯示 11 例在術后關節(jié)功能較術前明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義 (P< 0.05 )。IKDC 評分同樣是全世界范圍內應用最為廣泛的評分系統(tǒng)之一，僅次于 Lysholm 評分。IKDC 評分主要對膝關節(jié)運動損傷患者進行關節(jié)功能評估。本研究采用的 IKDC 評分為 2000 年修訂版，問卷簡單易懂，更加注重患者主觀感受。本研究顯示所有患者術后的 IKDC 評分在術后逐步提升，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05 )。

膝關節(jié) MRI 是目前臨床上評價關節(jié)軟骨狀況的最佳無創(chuàng)檢查手段。本研究中 11 例均于術前常規(guī)進行 MRI 檢查，術后 3 個月、術后 2 年以及末次隨訪時分別進行 MRI 檢查。術后各時期 MRI 可見移植后原軟骨缺損區(qū)逐漸填充修復，軟骨恢復平整光滑形態(tài)。MOCART 評分逐步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05 )。Alparslan 等[20]詳細描述了自體軟骨細胞移植術后不同恢復階段的 MRI 表現(xiàn)，筆者的研究中各階段 MRI 表現(xiàn)與該作者報道一致。

本研究存在一些不足之處。首先，本研究納入病例數(shù)不多。組織工程技術的快速發(fā)展促進了 ACI的更新?lián)Q代，生物支架的不斷改進以及軟骨細胞成品移植物的層出不窮，使得應用單一技術產(chǎn)品治療大量的膝關節(jié)軟骨缺損患者比較困難。其次，本研究沒有進行缺損區(qū)填充物的組織學檢查。Marcacci等[13]應用 MACI 技術治療 141 例膝關節(jié)軟骨缺損患者，術后組織學檢查大多是透明樣軟骨。張仲文等[14]對 10 例 MACI 患者進行為期 2 年的隨訪，并對部分患者行缺損區(qū)填充物活檢，顯示填充物為透明軟骨和纖維軟骨的混合體，以透明軟骨為主。二次關節(jié)鏡探查組織學檢查如顯示填充物為透明軟骨或者類透明軟骨，則對 ACI 的有效性更具說服力。但是本研究納入患者術后關節(jié)功能恢復良好，無疼痛不適癥狀，因此所有患者無意愿接受再次手術探查。

綜上所述，本研究結果表明，ACI 可有效治療膝關節(jié)軟骨缺損，術后關節(jié)功能評分顯著提高，MRI 顯示缺損區(qū)修復良好，長期隨訪效果滿意。ACI操作簡單，術后無明顯并發(fā)癥和不良反應發(fā)生。對于創(chuàng)傷原因導致的膝關節(jié)軟骨缺損患者，尤其是年輕患者，是一項安全、可靠、有效的治療手段。