早發(fā)性脊柱側凸肺發(fā)育與相關機械力的刺激

羅興鵬 王迎松 解京明 張穎 施志約 楊桂然

肺泡生長速度最快的時期是在 2 歲以前[1]，2～4 歲時，肺泡細胞數(shù)量達到成年人水平 ( 3 億～6 億個 )，這之后肺泡的數(shù)量、大小和復雜程度可能還會繼續(xù)緩慢增加，直至青春期甚至成年期[2-3]。越早發(fā)生在胸段的脊柱畸形，對胸廓的形態(tài)、活動度、容積影響就越大，同時產生的異常機械應力對肺細胞生長發(fā)育、組織分化的影響就越大。關于機械應力如何影響肺形態(tài)發(fā)生、功能和新陳代謝的機制，在細胞和分子水平上已取得了重大進展，例如，血流動力作用下內皮基因表達調控[4]、血管平滑肌[5]、骨和內皮細胞[6]中的機械轉導、異常應力與機械通氣肺損傷分子機制[7]等。

肺受到多種復雜的應力作用，包括呼吸、肺血流和表面張力。呼吸是肺的一個獨特功能，早在妊娠 10 周時，B 超就可以觀察到胎肺的“呼吸運動”。出生后，肺接受與整個體循環(huán)相同的血流量。這使得肺組織既承受氣體、液體流動產生的剪切力，又承受氣體膨脹、血流流動及呼吸運動產生的壓力拉伸。這些機械應力作用于多種肺細胞，包括肺泡上皮細胞、成纖維細胞、氣道上皮細胞、肺內皮細胞、平滑肌細胞以及間皮細胞。研究細胞如何感知機械應力刺激，細胞內和細胞間信號傳遞，以及在轉錄和轉錄后水平上的基因表達調控，可增加對機械應力與肺細胞相互之間關系的理解，有助于在細胞和分子水平上理解肺生理學和病理生理學，以及異常機械應力導致的多種肺疾病的病理生理情況。從而有助于設計預防和治療異常機械應力相關疾病的策略，如肺發(fā)育不良、脊柱畸形相關的肺生長受限、機械通氣創(chuàng)傷等。

一、體外模擬對肺細胞施加的各種應力及模型

除了機械拉伸，大量的空氣和血液流動還會產生流經氣道和血管壁的剪切應力。目前已有幾種裝置來模擬對肺細胞的這幾種類型的機械應力刺激。根據(jù)它們的主要物理特征可分為：靜態(tài)拉伸、循環(huán)拉伸、二維拉伸與三維拉伸、剪切應力作用、觸碰、扭曲等。

1. 靜態(tài)拉伸：在呼吸運動中肺受到氣流和血流的周期性拉伸，常用的靜態(tài)拉伸實驗裝置原理為通過工具垂直單向正壓推動，將培養(yǎng)在彈性膜上的細胞施加垂直雙向應力[8]( 圖 1a )，或者水平推動培養(yǎng)在彈性膜上的細胞[9]。單一的靜態(tài)拉伸裝置可以比較直觀地在顯微鏡下觀察及檢測細胞形態(tài)、細胞內 Ca2+和其它信號的變化。

2. 循環(huán)拉伸：常見的為 Flexercell 應變單元，用于在細胞上施加循環(huán)拉伸應力。該設備使用真空泵將覆蓋有細胞的彈性膜循環(huán)向下拖動 ( 圖 1b )。通過該裝置可以預測彈性膜內的任何位置的細胞應變分布[10]。

3. 三維培養(yǎng)基中拉伸細胞：在體外維持肺泡上皮細胞的表型是非常困難的，因為在一般的培養(yǎng)基中，肺細胞是分散培養(yǎng)的，當基質密度低時，Ⅱ 型細胞迅速變扁，失去產生表面活性物質的能力。但是用膠原蛋白海綿在三維環(huán)境中培養(yǎng)胎肺細胞卻可以維持肺泡細胞形態(tài)和表型[11]。這是因為膠原蛋白海綿被用作細胞黏附的底物時，分散的胎肺細胞聚集在海綿中，海綿周圍被間充質細胞包圍[12]，創(chuàng)造了一個高度組織化的“肺泡樣結構”( 圖 1c )。

4. 剪切應力：在流固界面上施加在流動方向上的單位表面積的摩擦力稱為剪切應力。具有代表性的模型為：Aparallel-plate 流動通道，它通過流體對單層培養(yǎng)的細胞施加剪切應力[13]( 圖 1d )。為了模擬微循環(huán)中的剪切應力，有學者還設計了玻璃微吸管灌注系統(tǒng)，在 20～50 μm的分支管中培養(yǎng)兔肺微血管內皮細胞，通過灌流施加剪切應力[14]。

5. 剪切應力和機械拉伸：氣道、肺血管和胸膜間隙不僅受剪切應力的影響，還受機械拉伸的影響。出生后的肺在呼吸運動膨脹收縮的同時還接受相當于整個體循環(huán)的血流量，且血管阻力較低。因此，流體剪切應力和機械拉伸對肺動脈內皮細胞的影響都是舉足輕重的。為了確定這兩個分量的相對貢獻，有學者開發(fā)了可以選擇性地控制剪切應力和機械拉伸的裝置[15]，以及跨毛細血管灌流培養(yǎng)系統(tǒng)[16]。

6. “觸碰”和“扭曲”設備：該設備通過選擇性地向單個細胞施壓，來模擬研究肺氣道上皮細胞所受的應力作用[16]。通過計算機顯微操作將尖端直徑為 1 μm 的玻璃移液管放置在單個細胞的頂膜附近。移液管由計算機控制向下接觸細胞，使細胞膜瞬間受到觸碰變形 ( 圖 1e )。另一種裝置讓細胞結合涂有特定受體配體的球形磁微珠。通過在一個方向上磁化這些珠子，然后施加第二個方向為 90°的較弱磁場，通過旋轉磁珠，從而在細胞表面上施加可控的剪切應力[17]( 圖 1f )。

二、不同的肺細胞在應力刺激下的反應

機械應力對肺不同細胞的增殖和分化有不同的影響，循環(huán)拉伸應力可刺激胎兒肺細胞增殖；在體外受循環(huán)拉伸機械應力作用下培養(yǎng)氣道平滑肌細胞可觀察到細胞數(shù)量和DNA 合成均有增加；循環(huán)拉伸應力還可下調前列腺素的生成，但是剪切應力作用卻相反。機械應力作用下細胞外基質的成分也會改變；剪切應力還能改變細胞的通透性。但是異常機械應力作用下則會引起促炎細胞因子和趨化因子的表達增加。

1. 胎兒肺細胞：胎兒呼吸運動所產生的循環(huán)拉伸是胎兒肺生長的重要刺激因素，模擬體外培養(yǎng)大鼠胚胎肺細胞并施加間歇性機械拉伸應力 ( 海綿伸長 5%，60 個周期 / min，15 min / h ) 該方案與報道的正常人類胎兒呼吸運動的頻率、幅度和周期性相似[18]，結果發(fā)現(xiàn)，妊娠第 19 天( 對應人肺發(fā)育的小管期 ) 胎兒大鼠肺細胞的 DNA 合成和細胞分裂增加[19]。這說明環(huán)拉伸應力刺激胎肺細胞的生長。

2. 氣道平滑肌細胞：氣道平滑肌細胞增生和肥大是哮喘、慢性阻塞性肺疾病和其它氣道阻力增高的慢性疾病的常見表現(xiàn)。犬氣道平滑肌細胞，用 Flexercell 應變單位進行循環(huán)應力拉伸體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)后 5 天或 14 天，細胞數(shù)量和 DNA 合成均有增加。細胞總蛋白含量，特別是肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶和結蛋白等收縮蛋白的含量比靜態(tài)培養(yǎng)細胞明顯增加[20]。這些結果表明過多的機械應力刺激會導致氣道平滑肌向病態(tài)方向發(fā)展。

圖 1 體外模擬對肺細胞施加的各種應力模型 a：細胞培養(yǎng)在彈性膜上，彈性膜由物體向上推動 ( 箭頭 )，產生拉伸應力；b：培養(yǎng)在彈性膜上的細胞被循環(huán)負壓向下拉 ( 向下箭頭 ) 產生循環(huán)拉伸應力；c：細胞培養(yǎng)在明膠海綿上，海綿的一端粘在培養(yǎng)皿的底部，另一端粘在金屬棒上，通過計算機控制的螺線管 ( 箭頭 )產生的磁力作用在金屬棒上，對海綿上的細胞施加應變；d：平行板流道對單層培養(yǎng)的細胞施加流體剪切應力；e：微吸管觸碰單個細胞的頂膜，使細胞膜變形；f：細胞表面受體鏈接磁珠上的配體，磁珠一個方向上磁化后，第二個較弱的磁場方向為90°“扭曲”，使珠子的剪切應力可控Fig.1 Simulations of various stress models applied to lung cells in vitro a: The cells were cultured on an elastic membrane, which was pushed upward by the object ( arrow ) to produce tensile stress; b: The cells cultured on the elastic membrane were pulled down by cyclic negative pressure ( downward arrow ) to produce cyclic tensile stress;c: The cells were cultured on a gelatin sponge; one end of the sponge was attached to the bottom of the culture dish, and the other end was attached to a metal bar; the magnetic force generated by a computercontrolled solenoid ( arrow ) acted on the metal bar and exerted strain on the cells on the sponge; d: Parallel plate exerted fluid shear stress on monolayer cultured cells; e: The micropipette touched the top membrane of a single cell, deforming the cell membrane; f: Receptors on the cell surface were connected to ligands on magnetic beads;After magnetization in one direction, the second weak magnetic field direction was “twisted” at 90°, so that the shear stress of the beads could be controlled

3. 細胞外基質：間歇拉伸誘導 Ⅳ 型膠原和肌原蛋白穩(wěn)態(tài) mRNA 水平升高。機械拉伸應力還通過上調纖維連接蛋白的合成和分泌來增加纖維連接蛋白的產生[21]，使得細胞之間緊密連接更穩(wěn)固。循環(huán)拉伸應力最初導致牛肺動脈內皮細胞減少纖維連接蛋白的釋放，但是隨著拉伸時間的延長，培養(yǎng)基中的纖連蛋白開始接近非應力對照組，而細胞層相關纖連蛋白也顯著增加[22]，這些結果表明，肺動脈內皮細胞通過增強與細胞黏附相關的分子成分來響應循環(huán)拉伸應力。

4. 炎癥介質產生和細胞損傷：機械通氣是治療呼吸衰竭不可缺少的治療方式，但同時也會誘導或加重潛在的肺損傷。模擬機械通氣離體大鼠肺模型中收集的灌洗液中：包括巨噬細胞炎癥蛋白-2、干擾素-γ、細胞因子[ 腫瘤壞死因子 ( tumor necrosis factor，TNF )-α、白介素( interleukin，IL ) 如 IL-1、IL-6、IL-10 ]增加[23]。肺機械通氣過程中產生的炎癥細胞因子可能導致急性肺損傷和多器官功能障礙綜合征的發(fā)展。機械拉伸應力，可增加人肺泡上皮細胞分泌 IL-8，但是過多增加拉伸程度 ( 10% 伸長率 ) 或連續(xù)拉伸應力，則可誘導胚胎肺細胞的損傷，這與促炎細胞因子和趨化因子的表達增加有關[24]。

5. 前列腺素的合成：由氣道上皮細胞合成的具有生物活性的二十烷類物質有助于調節(jié)氣道平滑肌張力和炎癥反應。在機械通氣中，氣道進行循環(huán)伸展，循環(huán)拉伸應力可下調人氣道上皮細胞中前列腺素 ( prostaglandin，PGs ) 的合成，包括 PGE2、PGI2 和血栓素 A2[25]，相反，剪切應力可增加肺內皮細胞釋放前列腺素。

6. 通透性：當牛肺泡表面細胞培養(yǎng)基流速增加即產生剪切應力增加時，細胞的通透性也增加[26]，肺胸膜表面的間皮細胞是肺表面和胸膜間隙之間的界面，在肺和周圍液體和組織之間提供屏障。由于肺的呼吸運動，這些細胞暴露在高水平的機械刺激下。當肺擴張和收縮時，間皮細胞被周期性地拉伸、收縮。在肺擴張時，肺胸膜的一些區(qū)域相對于胸壁胸膜滑動，因此受到流體剪切應力。在細胞流體剪切力研究模型中，這些細胞的通透性可被流體剪切應力可逆地改變，這表明間皮細胞的屏障功能隨著流體剪切力的變化而變化。

三、展望

早發(fā)性脊柱側凸 ( early onset scoliosis，EOS ) 會影響胸廓及心肺的發(fā)育，主要表現(xiàn)在對肺形態(tài)結構和功能的影響。側凸累及的椎體、肋骨越多，胸段、胸腰段側凸Cobb’s 角越大，患者的肺功能越差。當胸廓畸形復雜程度超過了呼吸肌的代償，可出現(xiàn)限制性通氣功能障礙為主的肺功能損傷，表現(xiàn)為以肺活量 ( vital capacity，VC )、用力肺活量 ( forced vital capacity，F(xiàn)VC )、最大自主通氣量( maximal voluntary ventilation，MVV ) 的顯著降低和 1 秒量( forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1 ) 的增加或正常為特征，也可出現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙以及混合型通氣功能障礙。頸胸彎、胸彎角度過大時可出現(xiàn)支氣管走形迂曲移位，血管彎曲，肋間隙變窄，壓縮側肺不張，膨脹側肺氣腫，V / Q 異常，肺內氣體交換面積減少，彌散功能下降，長期低氧血癥，肺血管收縮，此時肺動脈高壓有可能進展為肺心病，加之支氣管的迂曲移位狹窄，排痰困難，肺反復感染，進一步造成缺氧及二氧化碳潴留的惡性循環(huán)。

許多研究集中在機械應力對肺細胞生理功能的影響上。關于機械應力因素在 EOS 導致的胸廓、肺生長受限、肺細胞結構及功能受損等機制的報道較少。有幾種策略可用于研究物理因素在 EOS 中的作用：可以從動物模型或患者身上收集細胞，然后在體外研究它們對機械應力刺激的反應。另外，如果異常物理影響因素的性質被很好模擬的話，可以用各種設備來模擬這些條件。例如，可以模擬 EOS 的胸廓條件比較拉伸受限、正常拉伸和過度拉伸對細胞的影響；可用不同振幅、頻率和拉伸 - 松弛比干預細胞；在存在其它有害物理因素時，如高氧、缺氧和缺血再灌注時，應用機械應力刺激；或存在其它治療條件時，如由拉伸受限變?yōu)檎＠?( 模擬胸廓成形后的肺組織空間改善 )；在胸廓成形后對原生長受限的肺組織實施間充質干細胞的干預、生長因子的干預、激素的干預等；從而探索因脊柱側凸造成的肺功能受損患者的治療方法。還可以通過多種組合干預措施研究機械應力刺激與其它混雜因素之間的相互作用。例如，胎兒肺的成熟受機械應力因素和激素因素的控制。在良好的培養(yǎng)條件下，在限制的條件下，這些因素的作用和相互作用的研究。同樣，EOS應力失調與細菌產物、細胞因子、趨化因子和其它有害因子的相互作用可以同時在培養(yǎng)細胞上檢測。

機械力如何被細胞感知并轉化為細胞內信號轉導的生化信號以及各信號通路在基因轉錄、翻譯、表達調控中發(fā)揮的作用尚不清楚。由于器官結構的復雜性、細胞類型的多樣性以及細胞在體內所受應力的多樣性，不同細胞感知機械刺激的機制可能會有所不同。主要的應力相關信號轉導機制有，牽張 - 活化離子通道、細胞外基質 - 整合素 - 細胞骨架途徑 ( ECM-integrin-cell keleton pathway )、細胞 - 細胞黏附體連接和縫隙連接途徑[27]。在模擬 EOS 異常機械應力刺激引起的信號轉導通路是否有不同的表現(xiàn)形式，在有其它刺激 ( 治療或有害 ) 的情況下會發(fā)生怎樣的信號轉導改變，仍需進一步研究。一個特定基因的表達通常由其啟動子和增強子中的幾個轉錄因子控制。應力和其它因素可能會選擇性地影響其活動。此外，從基因轉錄和翻譯到翻譯后修飾的多個步驟也可能受到異常應力和其它信號的不同調控。