RNAⅢ抑制肽對不同生長時相金黃色葡萄球菌毒力因子表達的影響

周 穎 侯 征 薛小燕 魏 明 李 汾 姚 佳 張 曄 汪 洋

1.西安醫學院藥理學教研室，陜西西安 710021；2.空軍軍醫大學藥理學教研室，陜西西安 710032；3.西安醫學院分子病毒與病毒免疫學實驗室，陜西西安 710021

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的群體感應系統-附屬基因調節（agr）系統，調控多種毒力因子表達[1-3]，其中最重要的一類毒力因子是葡萄球菌溶素[4-6]。MRSA 還能夠表達一些黏附蛋白，促進細菌生物膜的形成。這些毒力因子在MRSA 侵襲性感染過程中發揮重要作用[7-8]。RNAⅢ抑制肽（RIP）是agr 系統抑制劑。本研究設計合成了新的RIP 衍生物RIP1183，檢測其對MRSA 的生長和生物膜形成的影響，以及在不同時相對重要毒力因子表達的影響，探討RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ELx800 酶標儀（美國Bio-tek 公司）；AL204 電子天平（梅特勒-托利多）；ZHWY-200D 恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；MX3005P1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（美國安捷倫）。微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN），細菌RNA 提取試劑盒RNAprep pure Bacteria Kit，反轉錄試劑盒PrimeScript Kit，Premix Taq RT-PCR 系統（TaKaRa）。異硫氰酸熒光素（FITC）、葡萄糖均購自Sigma 公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 菌株和藥品

MRSA（USA300）由美國國立衛生研究院（NIH）的Michael Otto 教授友情惠贈。RIP1183 由本課題組設計，委托空軍軍醫大學生物制藥教研室合成，白色疏松粉末，批號：20141001，含量：99.41%，保存條件：-20℃低溫保存。

1.3 細菌培養

按照1∶100 的比例接種MRSA（USA300）至5 mL的培養基中，37℃振蕩培養14 h，將過夜培養的細菌分別轉接至10 mL TSB 培養基 （含0.5%的葡萄糖），將細菌濃度調整至1×108CFU/mL。RIP 組加入RIP1183使其終濃度為50 μg/mL。對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃振蕩培養，每隔2 h 測定1 次吸光度（OD）630值，監測12 h 內細菌生長情況，實驗重復3 次。

收集菌體，細菌培養操作同上，每隔2 h 吸取100 μL 菌液，12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄去上清，收集沉淀（細菌），保存至-80℃冰箱中。

1.4 細菌生物膜

細菌過夜培養，用含有0.5%葡萄糖的TSB 培養液將菌液稀釋至1×106CFU/mL，接種于48 孔培養板中。RIP 組加入RIP1183，使藥物終濃度為50 μg/mL，對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃濕盒中孵育48 h后，棄上清，無菌磷酸鹽洗掉浮游菌和雜質。然后用FITC（0.1 mg/mL）標記貼壁細菌，無菌磷酸鹽清洗3 次，避光4℃保存，熒光顯微鏡（Olympus，CKX41）觀察貼壁細菌并拍照。使用Image J 軟件定量分析熒光強度。

1.5 qRT-PCR

為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相，agr 系統的激活情況，以及RIP1183 對細菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別檢測細菌遲緩期（2 h）、對數期（6 h）和穩定期（10 h）16S rRNA、RNAⅢ、人類白細胞抗原（HLA）、icaA 和fnbA 基因的表達水平。

收集的細菌，按照微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit 說明書，提取細菌總RNA。將RNA 溶于30 μL的DEPC 水，然后用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit 獲得cDNA。qRT-PCR 反應：反應體系20 μL，包括cDNA 2 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上游引物（10 μm）1 μL，下游引物（10 μm）1 μL，無菌ddH2O 6 μL。反應條件：segment 1：95℃、5 min；segment 2：95℃、10 s，55℃、30 s，40 個循環；segment 3：95℃、15 s，55℃、60 s，95℃、15 s；每個反應重復3 次。用2-ΔΔCT法計算分析各組基因相對于內參基因16S rRNA的表達量。用于檢測基因表達水平的引物序列，見表1。

表1 用于檢測基因表達水平的引物序列

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism Version 5.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，采用獨立樣本t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響

MRSA（USA300）培養在含葡萄糖的TSB 培養基中，2 h 后由遲緩期進入對數期，8 h 后進入穩定期；RIP 組加入RIP1183（50 μg/mL），MRSA（USA300）同樣是在2 h 進入對數期，8 h 后進入穩定期。與對照組比較，RIP1183 不影響細菌生長，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響

2.2 RIP1183 對細菌生物膜形成的影響

與對照組比較，RIP 組細菌生物膜形成顯著減少（P ＜0.01）。見圖2。

2.3 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA基因表達水平的影響

遲緩期（2 h），兩組RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達水平都較低；對數期（6 h），RNAⅢ和HLA 表達水平快速升高；穩定期（10 h），RNAⅢ和HLA 表達水平下降，但是生物膜形成的黏附相關基因（icaA 和fnbA）的表達水平升高。

遲緩期（2 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ表達明顯降低（P ＜0.05）。對數期（6 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ、HLA 表達顯著降低（P ＜0.01）；穩定期（10 h），與對照組比較，RIP 組icaA、fnbA 和RNAⅢ表達顯著降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

圖2 RIP1183 對細菌生物膜形成的影響

表2 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表達水平的影響（，n=6）

表2 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表達水平的影響（，n=6）

注：與對照組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；HLA：人類白細胞抗原；RIP：RNAⅢ抑制肽

3 討論

agr 群體感應系統是金黃色葡萄球菌的重要調控系統，參與調節細菌多種生理活動，對于維持金黃色葡萄球菌生物膜結構和細菌的致病性也是必不可少的[9-10]。RNAⅢ是agr 系統的效應分子，agr 系統激活后，RNAⅢ表達水平升高，RNAⅢ通過與靶基因5’非翻譯區（5’UTR）反義堿基配對，形成RNA 雙鏈體，從而進一步調控一系列靶基因的表達[11-12]。RNAⅢ調控多種毒力因子表達包括葡萄球菌溶素和細菌生物膜形成相關蛋白的表達。其中最重要的1 種葡萄球菌溶素是α-溶血素，由HLA 基因編碼，它可以破壞宿主多種細胞的細胞膜，改變細胞滲透壓，使宿主細胞溶解[4,13-14]。動物實驗[4-5]表明，敲除金黃色葡萄球菌HLA基因后，顯著降低了其對感染動物的致病性。纖連蛋白結合蛋白FnbA 是由fnbA 基因編碼的1 種多閾結構的蛋白質，它能夠吸引并黏附宿主的纖維蛋白原，介導金黃色葡萄球菌黏附于生物體表面，并使細菌逃離免疫系統的識別，是生物膜形成的黏附階段的重要調控蛋白[15-17]。icaA 基因編碼的蛋白是1 種普遍存在于金黃色葡萄球菌中的跨膜蛋白，具有N-乙酰葡萄糖氨基轉移酶活性，與細菌生物膜的形成有直接關系，也是生物膜形成的必要因素[15]。

據文獻[18]報道，在培養基中補充葡萄糖，可以促進細菌生物膜的形成，因此本研究采用含有葡萄糖的TSB 培養基培養MRSA（USA300），發現RIP1183 不影響MRSA（USA300）的生長，結果與文獻報道的群體抑制劑不影響細菌生長的結論相一致[19]。但是體外生物膜形成實驗結果顯示，RIP1183 可以顯著抑制MRSA（USA300）生物膜的形成。為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相agr 系統的激活情況，以及RIP1183對葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別在細菌遲緩期（2 h）、對數期（6 h）和穩定期（10 h），檢測了RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因的轉錄水平。結果顯示，遲緩期（2 h）是細菌轉接后對新環境的短暫適應過程，4 種基因RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達水平都較低；進入對數期（6 h）后，細菌快速增殖，RNAⅢ表達水平快速升高，顯示agr 系統被激活，HLA表達也快速增高；進入穩定期（10 h）后，HLA 表達下降，但是與生物膜形成的黏附相關基因（icaA 和fnbA）的表達水平升高。MRSA 通過agr 群體感應系統，在不同時相調控不同的毒力因子的表達，以適應不同生長環境。對數期，釋放大量葡萄球菌溶素，增加細菌的毒力和致病性；到了穩定期，黏附相關蛋白表達水平增高，促進細菌生物膜的形成，有利于細菌對抗外界極端環境（如營養缺乏、低pH、高滲透壓或抗生素等），這是細菌非常重要的環境適應機制[20-21]。

更重要的是，在3 個時相，RIP1183 均能顯著抑制RNAⅢ表達，同時顯著降低對數期HLA 的表達及穩定期生物膜黏附相關基因（icaA 和fnbA）的表達水平。本研究結果提示，群體抑制劑RIP1183 能通過干擾細菌agr 系統，影響不同時相，不同基因的表達，從而破壞細菌對環境適應機制，可能是其抗MRSA 活性的重要機制之一。另外，群體感應系統抑制劑不影響細菌的生長，不會或幾乎不會給細菌造成選擇性生存壓力，引起細菌耐藥的可能性比較小[22]。因此，抑制群體感應系統可能成為治療MRSA 生物膜相關感染性疾病的新策略。