薏苡仁油對小鼠腸道菌群及炎癥因子的影響

王 韜 費建東 聶雙發 李 磊

河北北方學院附屬第一醫院胃腸外科，河北張家口 075000

薏苡仁油，是從薏苡仁中提取出的一種活性成分，在中醫上具有益氣養陰、消癥散結的功效。中藥的藥效與腸道菌群存在著密切的聯系，進入消化道的中藥不可避免與腸道菌群接觸，會對腸道菌群結構產生調節作用或其他影響[1]。有些補益類中藥會促進腸道內某些益生菌的生長、繁殖，而某些清熱解毒類中藥會抑制一些有害菌的生長、繁殖及炎癥因子的表達[2]。近年來，腸道菌群的相關研究一直是熱點[3-5]，但還未有相關研究對薏苡仁油是否對腸道菌群有調整作用進行驗證。因此，本文旨在探討薏苡仁油對小鼠腸道菌群失衡的調控研究，以及其對腸道炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡SPF 級健康雄性昆明小鼠75 只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，體重（20±2） g，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，實驗動物均已通過倫理委員會審批。

1.2 主要試劑

薏苡仁油（批號：1503163-1）購于浙江康萊特藥業公司；鹽酸林可霉素（批號：L0166-201408）購于百靈威科技有限公司；Qiagen RNeasy Mini Kit 試劑盒（貨號：74104）購于北京碧橙藍生物科技有限責任公司；cDNA 逆轉錄試劑盒 （TOYOBO）（貨號：fsq-101）購于上海松雷生物科技有限公司；SYBR Green 染料（TOYOBO）（貨號：QPK-201）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物造模與分組 按照隨機數字表法將小鼠分為5 組，即空白對照組、造模組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15 只。造模使用林可霉素灌胃干擾小鼠腸道菌群，0.3 mL/次，2 次/d，連續灌胃3 d，小鼠出現腹瀉現象，氣相色譜法檢測小鼠糞便中的短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸，對應的出峰時間沒有出峰，即建模完成。空白對照組采用等劑量的生理鹽水進行灌胃，0.3 mL/次，2 次/d，連續灌胃3 d。造模過程中無模型的脫落。

造模后，造模組和空白對照組給予0.33 g/（kg·d）生理鹽水，低、中、高劑量組分別給予0.17、0.33、1.00 g/（kg·d）薏苡仁油進行灌胃30 d，實驗完成后頸椎脫臼處死小鼠，稱其體重。嚴格按照無菌操作規范，取出實驗所需結腸，行后續實驗分析。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 取一部分結腸，用甲醛固定，固定好的組織沖洗過夜后，分別用70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇進行脫水各1 h，石蠟包埋，切成4 μm 切片，HE 染色，封片。顯微鏡觀察。

1.3.3 腸道菌群的測定 在無菌條件下，在結腸樣本中各刮出0.2 g 腸道內容物，1 mL 無菌水稀釋，轉入滅菌eppendorf（EP）管中。隨后震蕩30 min 充分混勻后，吸取0.5 mL 轉入另一EP 管內，繼續震蕩10 min。稀釋到10-6mmol/L 后，將最后的樣品吸取50 μL 涂布到無菌選擇性培養基中，每個稀釋度做3 個重復樣本。在37℃條件下，雙歧桿菌、乳酸桿菌在無菌厭氧環境下培養24 h，腸球菌、腸桿菌在普通環境下培養24 h進行計數，取其平均值。參考《保健食品檢驗與評價技術規范（2003 年版）》[6]要求培養后統計其菌落總數，結果以常用對數值logCFU/g 表示。

1.3.4 炎癥因子的測定 用液氮研磨法將冷凍小鼠回腸組織勻漿，用不含EDTA 的胰酶消化收集，收集總數約為1×106個細胞。取5×105個/mL 接種于6 孔板中，每孔2 mL 培養液，用trizol 法提取總RNA。棄去培養液，取總RNA（根據濃度計算體積）1 μg，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。PCR 反應體系（20 μL）為cDNA 第一鏈產物1 μL，DreamTaq Green PCR Master Mix（2×） 10 μL，10 μmol/L 上游引物0.2 μL，10 μmol/L 下游引物0.2 μL，ddH2O 為8.6 μL。上述反應體系振蕩混勻后置于PCR 儀中進行循環擴增。擴增條件為95℃預變性3 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，持續30 個循環。取每組PCR 產物各5 μL 在瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳30 min 后，用凝膠成像系統掃描、分析，以白細胞介素（IL）-6、趨化因子2（CCL2）、IL-1α、IL-1β 與內參β-肌動蛋白（β-actin）積分吸光度IA 比值進行分析，實驗重復3 次。具體引物序列如表1。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較用采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

表1 各組基因引物序列

2 結果

2.1 各組小鼠結腸組織病理形態觀察

空白對照組小鼠結腸黏膜結構完整，腸絨毛正常，無炎癥細胞浸潤；造模組小鼠結腸黏膜結構破壞，層次不清，彌漫炎癥細胞浸潤；低劑量組小鼠結腸黏膜結構基本完整，腸絨毛減少，炎癥細胞浸潤于腸絨毛內及上皮全層；中劑量組小鼠結腸黏膜結構基本完整，腸絨毛減少，炎癥細胞較少，只浸潤于腸絨毛內；高劑量組小鼠結腸黏膜結構完整，腸絨毛正常，基本無炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理形態（HE，400×）

2.2 各組小鼠結腸菌群結果比較

造模組小鼠結腸中腸球菌、腸桿菌計數高于空白對照組；雙歧桿菌、乳酸桿菌計數低于空白對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。低、中、高劑量組小鼠結腸中腸球菌、腸桿菌低于造模組；雙歧桿菌、乳酸桿菌高于造模組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。各劑量組間各結腸菌群結果比較，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結腸菌群結果比較（logCFU/g，）

表2 各組小鼠結腸菌群結果比較（logCFU/g，）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

2.3 各組小鼠體重比較

第0、15、30 天，造模組小鼠體重低于空白對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。第15 天，中、高劑量組小鼠體重高于造模組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。第30 天，低、中、高劑量組小鼠體重高于造模組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。第15、30天，各濟量組間小鼠體重比較，差異有統計學意義（P <0.05）。見表3。

表3 各組小鼠體重比較（g，）

表3 各組小鼠體重比較（g，）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

2.4 各組小鼠炎癥因子比較

造模組IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 水平高于空白對照組；低、中、高劑量組IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β水平低于造模組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。各劑量組間差異有統計學意義（P < 0.05）。見表4。

表4 各組小鼠炎癥因子比較（pg/mL，）

表4 各組小鼠炎癥因子比較（pg/mL，）

注：與空白對照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

3 討論

禾本植物薏苡的成熟種仁主要含蛋白質、脂肪、碳水化物[7]。《中華人民共和國藥典》[8]里提到其種仁可以清熱解毒、健脾止瀉、鎮痛、可供食用，在中醫中用于治療水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、贅疣、癌腫。薏苡仁油是從薏苡仁中提取得到的脂肪油。研究發現[9-11]，薏苡仁油中的主要成分有薏苡仁酯、薏苡內酯、棕櫚酸、硬脂酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、肉豆蔻酸、甾醇類、角鯊烯和維生素E等。以薏苡仁油為主要成分的抗腫瘤藥物康萊特注射液已經在臨床上廣泛應用[12-13]，但薏苡仁油藥理方面的研究不僅僅局限于抗腫瘤，也能夠改善菌群失衡、抑制炎癥因子的功能。

微生物與健康的關系一直是人們關注的話題，但長期以來對腸道微生物與健康關系的了解卻非常有限。隨著新的研究方法的不斷出現，腸道微生物對人類健康的影響重新引起重視，成為當前生命科學和醫學的研究熱點[14-18]。腸道微生物又被認為是人體的第二基因組，與人體基因組一起，通過與環境因素的相互作用，通過不同方式影響健康[19]。腸道就是免疫系統的最前線的基地。體內約70%的免疫細胞集中在腸黏膜，而且使這些免疫細胞活化的，正是腸道細菌[20-21]。本研究結果發現，低、中、高劑量組小鼠結腸中腸球菌、腸桿菌低于造模組；雙歧桿菌、乳酸桿菌高于造模組（均P < 0.05）。提示薏苡仁油對林可霉素小鼠模型的腸道菌群失衡具有很好的調節作用。此外，薏苡仁油還能夠增加菌群失衡小鼠的體重，間接說明小鼠各臟器蛋白合成能力提高。

研究顯示[22-24]，炎癥性腸病被認為是腸道微生物失衡產生的刺激，引發遺傳易感個體對腸道共生菌的異常免疫應答，進而造成腸道損傷。許多中藥都有調節腸道微生態平衡的作用[25-27]。通過各組小鼠結腸組織病理形態觀察可見，菌群失衡小鼠結腸黏膜結構破壞、層次不清、彌漫炎癥細胞浸潤，薏苡仁油能夠改善結腸黏膜直至接近正常。

IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 為人體的前炎癥因子，對于炎癥反應有很大的預示作用，因此本研究測量了這些前炎癥因子，反映了小鼠整體的炎癥情況[28-32]。其中IL-1、IL-6 是由一組單核巨噬細胞、內皮細胞產生的細胞因子，具有激活T、B 細胞分化，增強自然殺傷細胞殺傷靶細胞，促進吞噬功能，也是機體炎癥反應和一系列病理生理過程的重要炎癥介質。CCL2 在感染或損傷過程中產生高濃度，并決定炎癥性白細胞向受損區域的遷移。對腸道炎癥因子的檢測結果發現，薏苡仁油有效地抑制了林可霉素小鼠模型腸道炎癥因子IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 的表達。因此，薏苡仁油的應用不應僅僅局限于癌癥治療，還可以擴展到炎癥性腸病的治療中。

綜上所述，薏苡仁油可改善小鼠的腸道菌群失衡，并抑制腸道炎癥因子表達。隨著科學的進步，人類將更深入地從細胞、分子、基因水平對薏苡仁油的功效與臨床應用進行更深入的研究。