黃精糕減壓提取與常壓提取降血糖活性成分的比較研究

李俊明 向茗 陳光宇 吳鈺 何群 謝夢洲

摘 要：目的：考察減壓與常壓提取對黃精糕降血糖活性成分的影響，從而優(yōu)選一種科學、合理、穩(wěn)定、可行的提取方法。方法：以黃精糕中降血糖活性成分和指標成分總黃酮、總多糖、葡萄糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷與干浸膏得率為評價指標，先用常壓回流提取L9（34）正交設計試驗法優(yōu)化醇濃度、加溶劑量、提取時間、提取溫度等常壓與減壓共有的提取工藝參數(shù)，再采用最佳工藝參數(shù)進行減壓提取，95%可信區(qū)間重疊法比較減壓與常壓提取各成分的差異。結(jié)果：常壓提取最佳工藝參數(shù)為：先用醇常壓提取1次，加12倍量70%的乙醇，60℃提取1 h，再用水提2次，加水量分別為藥材量的12、10倍，水提溫度90℃，時間分別為2、1.5 h，減壓提取醇濃度、加溶劑量、提取溫度、提取時間皆同常壓提取，僅提取壓力為70%醇提150 hpa，水提70 hpa，減壓提取醇提液中總黃酮、鞣花酸含量高于常壓提取（P<0.05），減壓提取水提液中葡萄糖含量高于常壓提取（P<0.05）。結(jié)論：減壓提取優(yōu)于常壓提取，減壓提取最優(yōu)工藝參數(shù)為70%醇提70 hpa，水提150 hpa，先用70%乙醇減壓提取1次，加入12倍量70%的乙醇，60℃減壓提取1 h，再用水減壓提取2次，加水量分別為藥材量的12、10倍，水提取溫度90℃，時間分別為2、1.5 h。減壓提取工藝科學、合理、穩(wěn)定、可行，可為工業(yè)生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

關鍵詞：黃精糕;減壓提取;常壓提取;總黃酮;總多糖;鞣花酸;山柰酚-3-O-蕓香糖苷

黃精糕由黃精、玉竹、覆盆子、山藥、桑葚、枸杞等六味藥食同源中藥組成，經(jīng)提取后加輔料制成普通食品，該組方主要降血糖的活性成分為總多糖、總黃酮[1-8]。藥理研究表明，鞣花酸[9-10]具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌及增強免疫、降血糖的作用，山柰酚-3-O-蕓香糖苷和覆盆子酮皆屬于黃酮類成分，具有降血糖功效。原普通食品提取工藝未經(jīng)優(yōu)化未將降血糖活性成分充分提取完全，為了最大限度地提取降血糖活性成分，本試驗對黃精糕原藥材提取工藝進行了優(yōu)化。因本品降血糖活性成分易氧化分解損失，適合采用減壓提取[11]，藥材內(nèi)外形成壓力差，有助于藥材細胞內(nèi)活性成分快速向溶液遷移。為探討黃精糕原藥材是否適合減壓提取，比較常壓、減壓兩種提取方法的差異，本試驗首先優(yōu)化常壓下的最佳提取工藝參數(shù)，然后以常壓提取的最優(yōu)參數(shù)進行減壓提取，與常壓提取比較。根據(jù)組方中各味藥材所含的降血糖活性成分理化性質(zhì)，全方先醇提1次、醇提藥渣再水提2次，以總黃酮、鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、干浸膏得率為評價指標優(yōu)化醇提工藝參數(shù);以總多糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、干浸膏得率、葡萄糖為評價指標優(yōu)化水提工藝參數(shù)。紫外-可見分光光度法測定各試驗樣品中總黃酮、總多糖的含量、HPLC法測定鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量，質(zhì)譜法測定葡萄糖的含量。考察提取方法及工藝參數(shù)對降血糖活性成分的影響，為黃精糕原藥材提取工業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

液相色譜柱，月旭科技上海股份有限公司（填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠Ultimate XB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm）;鞣花酸對照品（LOT：SJ0717GE14），上海源葉生物科技有限公司;山柰酚-3-0蕓香糖苷對照品（LOT：Y22J11H119335），上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖對照品（20161219），上海沃凱生物技術有限公司;蘆丁對照品（100080-201811），中國食品藥品檢定研究院。黃精、玉竹、覆盆子等六味中藥，均由湖南省新化縣綠源農(nóng)林科技有限公司提供，經(jīng)我校王智老師鑒定皆符合2020版《中國藥典》一部有關規(guī)定。試劑均為分析純;實驗室用水為純化水。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)（包括G1316A四元梯度泵、G1313A標準型自動進樣器、G1316A恒溫箱、G1314A紫外檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;紫外-可見分光光度計UV900B，北京萊伯泰科;電子天平（ATX124型124 g～0.000 1 g），東京島津儀器有限公司;10 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器N-3010，日本東京理化;冷凍干燥機（SCIENTZ-10N），寧波新芝生物科技股份;水分測定儀（SFY-20BL），深圳市冠亞水分儀科技;電熱鼓風干燥箱（101-1AB），北京中興偉業(yè)儀器;超高效液相色譜儀（Acquity uplc h-class plus），美國Waters公司;三重四級桿質(zhì)譜儀（TripleQuad 3500），AB SCIEXDISTRIBUTION公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法測定樣品中鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量

2.1.1 對照品溶液的制備 （1）鞣花酸對照品溶液的制備：取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含5 μg的溶液，即得。（2）山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液的制備：取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取各樣品干浸膏2 g，精密稱定，加入70%的乙醇或純化水溶解（醇提干浸膏用70%乙醇溶解，水提干浸膏用純化水溶解），定容至250 mL，然后稱重。將每份供試品溶液超聲30 min，再次稱重，用70%的乙醇或純化水補足減失的重量。

2.1.3 鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷測定色譜條件

本方法采用液相色譜法（參考2020版《中國藥典》第四部通則0512）測定黃精糕中鞣花酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量。除另有規(guī)定外，按下列方法測定。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、以0.1%磷酸水溶液為流動相B、柱溫30 ℃、流速1.0 mL/min、檢測波長為254 nm。按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫。

（1）空白對照溶液的制備：取甲醇溶液，用0.22 μm有機微孔濾膜濾過，即得，或稱為空白對照液。（2）對照品溶液的制備：取鞣花酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含鞣花酸濃度為10.14 μg、山奈酚-3-O-蕓香糖苷濃度為193.1 μg的對照品溶液，即得，或稱為鞣花酸對照液、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照液。（3）黃精糕供試品溶液的制備：將各黃精糕樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得或稱為各黃精糕供試液。（4）測定法：精密吸取上述空白對照液、鞣花酸對照液5 μL、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照液5 μL、各黃精糕供試液10 μL注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.1.4 測定法 鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷：分別精密吸取鞣花酸對照品溶液10 μL，山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液10 μL與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得（圖1～圖7）。

2.2 超高液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定樣品中葡萄糖含量方法

本方法采用液相色譜法（參考2020版《中國藥典》第四部）測定各樣品中葡萄糖含量。除另有規(guī)定外，按下列方法測定。

2.2.1 對照品溶液的制備 （1）空白對照溶液的制備：取水溶液，用0.22 μm有機微孔濾膜濾過，即得。（2）對照品溶液的制備：取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80%乙腈制成含葡萄糖濃度為10 μg的對照品溶液，即得，或稱為葡萄糖對照液。

2.2.2 供試品溶液的制備 按2.1.2項制備水提干浸膏溶液，將各樣品溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 色譜、質(zhì)譜條件 以氨基鍵合硅膠為填充劑（月旭科技上海股份有限公司，Ultimate XB-NH3型色譜柱，3 μm，2.1mm*150 mm）;以乙腈為流動相A、以水為流動相B、柱溫30 ℃、流速0.3 mL/min;按表2中的規(guī)定進行梯度洗脫，以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測;電噴霧離子源（ESI），采集模式為負離子模式;各化合物Q1母離子多重離子掃描，錐孔電壓（DP），入口電壓（EP）見表3。

1葡萄糖2201792010

2.2.4 測定法 精密吸取上述空白對照液、葡萄糖對照液1、2、5、7、10 μL，注入高效液相色譜-質(zhì)譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標、進樣質(zhì)量（ηg）為橫坐標，繪制標準曲線。另精密吸取上述各供試液1 μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出黃精糕供試液中相當于葡萄糖的濃度，計算，即得。測定結(jié)果見圖8～11。

2.3 紫外-可見分光光度法測定各試驗樣品中總黃酮、總多糖的含量

總多糖含量測定：參照2020年《中國藥典》第一部黃精多糖測定;總黃酮含量測定：采用鋁鹽顯色法[12]測定樣品總黃酮含量。

2.4 常規(guī)提取黃精等六味中藥降血糖活性成分的基本工藝

各樣品分別按處方比例稱取黃精、玉竹、覆盆子等6味中藥飲片，適當碎段，采用醇提1次，藥渣再水提2次的方法。醇提加一定濃度和用量的乙醇浸泡一定時間，不同溫度下提取一定時間，過濾。醇提后，藥渣再水提2次，加入一定量的水，不同溫度下提取一定時間，過濾。醇提濾液與水提濾液分別在50 ℃、30 r/min、30 hPa的條件下減壓濃縮后再冷凍干燥成干浸膏備用。

2.5 黃精等六味中藥常規(guī)提取工藝條件對降血糖活性成分的影響

2.5.1 黃精等六味中藥常規(guī)提取工藝條件優(yōu)化的正交設計試驗 醇提工藝下，選取對降血糖活性成分影響較大的提取工藝條件即乙醇濃度、加醇量、提取時間、提取溫度4個因素進行考察，以總黃酮、鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、干浸膏得率為評價指標，優(yōu)選出最佳醇提工藝;水提工藝下，先用最佳醇提工藝提取，然后再按水提正交設計水提2次。以2次的加水量，提取時間，提取溫度作為條件，以總多糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、干浸膏得率為評價指標，優(yōu)選出最佳水提工藝。采用L9（34）正交設計試驗法考察不同提取條件對各降血糖活性成分的影響，因素水平設計見表4、表5。按2.1、2.2、 2.3項下測定并計算各試驗樣品中相關成分的含量，結(jié)果見表6、表9。因素間方差分析見表7、表10，水平間方差分析見表8、表11。根據(jù)統(tǒng)計分析，綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)時間、成本等問題，確定醇提最佳工藝為A3B2C3D1，即乙醇濃度70%、加醇量12倍、提取時間1 h、提取溫度60 ℃。

2.5.2 黃精等六味中藥醇提工藝的驗證試驗結(jié)果 對黃精、玉竹、覆盆子等6味中藥的醇提最優(yōu)工藝條件進行驗證：取3批黃精、玉竹、覆盆子等6味藥食同源中藥飲片，每批60 g，適當碎斷，加70%乙醇，12倍的量，60 ℃水浴，提取1 h，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃、30 r/min、30 hPa的條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=1.5：1左右，再冷凍干燥成干浸膏粉（含水量<5.0%），測得總黃酮含量為28.20%，RSD=2.76%，鞣花酸含量為0.206 3%，RSD=2.45%，山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量為0.006 4%，RSD=2.86%，干浸膏得率為38.97%，RSD=1.54%，提取工藝驗證結(jié)果皆接近或高于正交設計試驗中的最高值，表明此工藝條件可最大限度提取出降血糖活性成分，該醇提工藝參數(shù)科學、合理、穩(wěn)定、可行、適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

根據(jù)統(tǒng)計分析，綜合工業(yè)生產(chǎn)時間、成本等問題，確定水提最佳工藝為A2B3C1，即加水量分別為12、10倍，提取時間分別為2、1.5 h，提取溫度90 ℃。

2.5.3 黃精等六味中藥水提工藝的驗證試驗結(jié)果 取3批取3批黃精、玉竹、覆盆子等6味藥食同源中藥飲片，每批60 g，適當碎斷，按照最優(yōu)醇提工藝提取后，過濾，藥渣再按照最佳水提工藝提取2次。合并2次水提濾液，在50 ℃、30 r/min、30 hPa的條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=1.5：1左右，再冷凍干燥成干浸膏（含水量<5.0%），測得總多糖含量為10.01%、RSD=2.52%，鞣花酸含量為0.035%、RSD=2.69%，葡萄糖含量為1.970 5%、RSD=2.47%，干浸膏得率為25.87%、RSD=2.79%，提取工藝驗證結(jié)果皆略高于正交設計試驗中的最高值，表明此工藝條件最大限度提取出降血糖活性成分，該提取工藝參數(shù)科學、合理、穩(wěn)定、可行、適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.6 減壓提取與常壓提取的比較

分別取2份黃精、玉竹、覆盆子等6味藥材，每份60 g，1份在常壓下按照最佳醇提工藝提取后過濾，定容;再按照最優(yōu)水提工藝提取，過濾，定容。另1份藥材以相同的工藝參數(shù)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓提取，醇提時的壓力為150 hpa，提取液過濾，定容;水提壓力為70 hpa，水提2次提取液合并過濾，定容。正交試驗結(jié)果表明，醇提液中，鞣花酸的含量遠遠大于山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量，因此選擇鞣花酸為評價指標。水提時，由于水提液中未檢測到山柰酚-3-O-蕓香糖苷，鞣花酸的含量太低，考察醇提已有該指標，而總多糖的測定誤差較大，因此選擇葡萄糖含量為評價指標。

由表12可知，減壓提取醇提液中總黃酮、鞣花酸含量高于常壓提取（P<0.05）;減壓提取醇提液中總黃酮含量是常壓提取的1.154倍;減壓提取醇提液中鞣花酸含量是常壓提取的1.208倍;減壓提取水提液中葡萄糖含量高于常壓提取（P<0.05）;減壓提取水提液中葡萄糖含量是常壓提取的1.118倍。

3 結(jié)論與討論

中藥復方的成分復雜，其效應物質(zhì)基礎是復方所含的成分[13]，單一的考察指標不能篩選出最佳的提取工藝[14]，因此本試驗采用多指標成分考察的方法，篩選出最優(yōu)工藝。本試驗建立了同時測定鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量的色譜條件，可用于提取工藝條件研究中平行樣品的含量測定，使各樣品的測定結(jié)果具有可比性。同時本試驗建立了超高液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定葡萄糖含量方法，方法對比多糖測定具有先進性、科學性、準確性。鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷系易氧化活性成分，減壓醇提情況下，液面空氣中含氧量降低，可減少這兩種成分的損失;葡萄糖系還原糖，所含的醛基易氧化分解，減壓水提時可減少該成分的損失。◇

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Comparative Study on Decompression Extraction and Atmospheric Pressure Extraction of Hypoglycemic Active Components of Huangjing Cake

LI Jun-ming1，2，3，4，XIANG Ming1，2，3，4，CHEN Guang-yu1，2，3，4，WU Yu1，2，3，4，HE Qun2，XIE Meng-zhou1，2，3，4

（1 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China;

2 Hunan Provincial Medicine & Food Homologous Functional Food Engineering and Technology Research Center，Changsha 410208，China;

3 Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China;

4 The KeyLaboratory of Cardiopulmonary Disease Syndrome Differentiation and Medicinal Diet Therapy in Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of decompression and atmospheric pressure extraction on the hypoglycemic active components of Huangjing cake，and to select a scientific，reasonable，stable and feasible extraction method.Method Precise with yellow cake fall blood sugar in the active ingredient and index components flavonoids，total polysaccharide，glucose，ellagic acid，kaempferol-3-O-rutinosideand dry extract yield as evaluation index，with atmospheric circumfluence extraction L9 （34） orthogonal experimental design method to optimize the extraction process parameters，the optimum processing parameters of atmospheric pressure extraction，the decompression by optimum parameters of atmospheric pressure extraction to extract，95% confidence interval overlapping method comparing the difference between the reduced pressure and atmospheric pressure from the component.Result Atmospheric pressure to extract the best technological parameters for：first use atmospheric pressure extraction time，alcohol and 12 times the amount of 70% ethanol，extract 60 ℃ for 1 h，and then water，secondary water added to 12 times the amount of medicinal herbs，10 times，the water temperature of 90℃，2 h，1.5 h，decompression，amount of solvent extraction and alcohol concentration，extraction temperature，extraction time with normal pressure extraction，extraction pressure of 70% alcohol extraction only 150 hpa，the water 70 hpa，vacuum extracting ethanol-extraction，ellagic acid，total flavonoids content in liquid is higher than normal pressure extraction （P<0.05），vacuum extraction and water extraction liquid of glucose levels higher than normal pressure extraction （P<0.05）.Conclusion The optimal process parameters of decompression extraction were 70% ethanol extraction 70 hPa and water extraction 150 hPa.First，70% ethanol extraction was extracted with decompression once，then 12 times of 70% ethanol was added for decompression extraction at 60℃ for 1 h，and then extracted with water for two times.The amount of water added was 12 times and 10 times of the amount of medicinal materials，and the water extraction temperature was 90℃ for 2 h and 1.5 h.The decompression extraction technology is scientific，reasonable，stable and feasible，which can provide a basis for industrial production.

Keywords：Huangjing cake;decompression extraction;atmospheric pressure extraction;total flavonoids;total polysaccharide;ellagic acid;kaempferol-3-O-rutinoside

基金項目：湖南中醫(yī)藥大學藥食同源工程中心開放基金資助（項目編號：2018YSTY06、2018YSTY07）;湖南省重點研發(fā)計劃項目（項目編號：2022SK2018）。

作者簡介：李俊明（1996— ），男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥膳學。

通信作者：謝夢洲（1964— ），女，教授，博士生導師，研究方向：中醫(yī)藥膳學。