辛芷滴鼻液、燒燙寧膏微生物限度檢查方法的研究

王艷　劉光斌　金文麗　何苗苗　謝靜

?研究探索辛芷滴鼻液、燒燙寧膏兩種含中藥的制劑微生物限度檢查法，進一步做方法學驗證。用平皿法進行需氧菌、霉菌和酵母菌計數;用常規法進行控制菌檢查。?5種試驗菌株回收率值在0.5?2范圍內，滿足《中國藥典》2015版四部微生物限度檢查法方法驗證試驗的要求。?本研究建立的方法操作簡便，可用于兩種制劑的微生物限度檢查。

：辛芷滴鼻液;燒燙寧膏;微生物限度檢查;驗證

辛芷滴鼻液是酒鋼醫院研制的用于治療慢性、萎縮性、過敏性鼻炎的一種含中藥滴鼻劑;燒燙寧膏用于治療Ⅰ、Ⅱ度以下燒燙傷。鼻炎癥狀嚴重影響患者的身心健康和生活質量，尤其是在西北寒冷地區，氣候干燥，晝夜溫差大，鼻炎發病率高，給患者帶來不可忽視的生活困擾，為此我院根據中醫理論和臨床實踐經驗專門研發了便于使用和攜帶的中藥滴鼻劑辛芷滴鼻液，臨床反應療效明顯。而燒燙寧膏則是針對輕度的燒燙傷治療的一種必要的補充制劑，滿足臨床需求。這兩種制劑中均含有不同成分的中藥提取液，因此在對其進行微生物限度的質量檢查過程中，應先查驗中藥成分是否具有抑菌性，從而建立有效的微生物限度檢查方法。由于這兩種制劑均為油性制劑，辛芷滴鼻液以麻油為基質，燒燙寧膏則是油性軟膏，本文在對這兩種制劑進行微生物限度檢查方法驗證時，嘗試了不添加乳化劑進行樣品的稀釋處理，而是用45 ℃保溫溶解，簡化操作步驟，同時也避免了乳化劑對試驗菌的干擾，實驗結果滿意，現報道如下。

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辛芷滴鼻液，規格：10mL/支，批號：20190702、20190806、20190904;燒燙寧膏，規格：20 g/支，批號：20190507、20190616、20191010;均由酒鋼醫院制劑室生產。

pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（稀釋液）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）、溴代十六烷三甲銨平板（CA）、甘露醇氯化鈉瓊脂平板（MSA），麥康凱液體和瓊脂培養基，均來源于青島海博。其他試劑均為分析純或化學純。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]（菌J）、銅綠假單胞菌[CMCC （B） 44104]（菌T）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]（菌K）、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]（菌B）和黑曲霉[CMCC（F）98003]（菌H）、大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]（菌D）購于中國食品藥品檢定研究院。以上菌株傳代次數不超過5代。

電子天平（YP5002，上海佑科）、壓力蒸汽滅菌器（上海三申）、細菌培養箱（LRH-80F，上海）、霉菌培養箱（MJX-80S，上海）恒溫水浴鍋、超凈工作臺（上海）、生物安全柜（BIOsafe12，上海力申）等。

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接種菌J、菌K、菌T的新培養體至TSB中，培育18～24h，用稀釋液配成每lmL含5000?10000cfu、500?1000cfu、50?100cfu的菌懸液：接種菌B的新培養體至SDB中，培育24～48h，用0.9%等滲無菌鹽水配成lml含5000-10000cfu， 500?1000cfu、50?100cfu的菌懸液。接種菌H的新培養體至SDB中，培育5?7d，加入3-5ml?0.9%等滲無菌鹽水，洗掉孢子后，緩緩吸取帶孢子的懸液（使用無菌紗布濾過菌絲）至無菌試管內，用0.9%無菌氣化鈉諮液稀釋制成每1mL含孢子數5000?10000cfu、500～1000cfu， 50?100cfu的孢子懸液。各菌種、菌懸液均不過5代。

辛芷滴鼻液：取辛芷滴鼻液10mL至無菌容器中，傾入45 ℃的稀釋液至100mL，溶解，混勻，制成1：10供試液。

燒燙寧膏：取燒燙寧膏10 g至無菌容器中，傾入45℃的稀釋液至100mL，溶解，混勻，制成1：10供試液。

（1）試驗組：取“2.2”下的供試液9.9 mL，加入菌J的菌液0.1mL，混勻，使l mL含菌量不超過100 cfu，吸取1ml加到無菌平皿中，隨即注入TSA。同法制備含菌K、菌T、菌B、菌H的供試液，各取1 mL同菌J操作。另外各取含菌B和菌H的供試液1 mL加到潔凈平皿中，隨即注入SDA。每種試驗菌株各平行制備2個平皿。?。

（2）供試品對照組：取1：10的樣品溶液，用緩沖液替代菌液同試驗組同法操作。

（3）菌液對照組：取稀釋液替代供試液，同試驗組試驗，添加各試驗菌。

（4）陰性對照組：用同批配制、滅菌的TSB 1ml替代供試品溶液，同試驗組進行操作。

驗證試驗分3次獨立完成，各試驗組分別采用上述供試品平行做3次。

各菌落計數方法按下式計算，回收率（R）=（試驗組平均菌數-供試品對照組平均菌數）/菌液對照組平均菌數。若0.5≤R≤2，則該法可行。若任何一次試驗中R<0.5，則該法不適宜。

辛芷滴鼻液與燒燙寧膏試驗結果均為R>0.5，說明該方法可行。試驗結果見表1、表2。

取“2.2”下的辛芷滴鼻液、燒燙寧膏1：10供試品溶液一次進行菌J、菌T及菌D的方法適用性檢查，結果按常規法可以檢出試驗菌相應反應特征。

辛芷滴鼻液和燒燙寧膏是酒鋼醫院根據臨床需求研制的醫院制劑，在臨床應用中發揮了積極作用。由于這兩種制劑都含有中藥成分，辛芷滴鼻液中含有辛夷、白芷等四味中藥;燒燙寧膏則含有紫草，黃芩等5味中藥。根據2015年版《中國藥典》的要求，所有制劑均應進行微生物限度的檢查，查閱各文獻，研究我院制劑微生物限度檢查方法對保證制劑質量意義重大。中藥原料來源多樣，微生物污染情況復雜且不易控制，而且有些中藥本身又有不同的抑菌性，若不進行方法驗證，將會導致微生物限度檢查結果不實。所以，驗證確定適宜的微生物限度檢查方法，將有效提高醫院制劑的安全性和有效性。而本法的驗證結果表明辛芷滴鼻液和燒燙寧膏中所含的中藥成分均對試驗菌沒有抑制作用。

2015版《中國藥典》對油脂類供試品的處理方法是取供試品，添加滅菌的十四烷酸異丙酯，或少量無抑菌性的乳化劑、表面活性劑促溶解。這些都是化學方法促溶，有潛在的干擾性，本實驗中的兩種制劑均為油脂類，在對供試品溶液制備過程中，筆者使用了水浴45℃加溫的物理方法促使供試品溶解，充分混勻，沒有加乳化劑，實驗結果表明，各菌回收率均在0.5～2，即用45 ℃水浴加溫溶解油脂性供試品可行，此方法較加入助溶劑更易操作，步驟簡單，更有利于日常的檢驗操作，同時也避免了添加劑的干擾因素，本法的驗證結果也為在微生物限度檢查過程中如何處理油性供試品提供了一種新的思路。尋找簡單有效且符合藥典要求的處理方法是很有必要的。

2015版《中國藥典》對鼻用制劑控制菌的限度要求除了不得檢出菌J和菌T之外，還不得檢出菌D，本文也針對控制菌做了方法驗證，均能按常規方法檢驗。

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